二氢杨梅素对糖尿病小鼠降糖作用研究_逯凤肖(1)

1、中药药理与临床 2016; 32( 3)45and immunolocation in prion diseases Biochem Soc Trans，2002; 30 ( 4) 387 3917 Fu H，Subramanian ，Masters SC 14-3-3 proteins: structure，func-tion and regulation Annu ev Pharmacol Toxicol，2000; 40617 6478Kleppe ，Toska K，Haavik J Interaction of phosphorylated tyrosinehydroxylase wi

2、th 14-3-3 proteins: evidence for a phosphoserine 40-dependentassociation J Neur-ochem，2001; 77( 4) 1097 11079Ouyang LF，Wang ZL，Dai JG，et al Determination of total ginsenosidesin ginseng extracts using charged aerosol detection with post-column compen-sation of the gradient Chin J Nat Med，2014; 12 (

3、11) 857 86810Zhou DH，Zhao F，Nisbet AJ，et al Comparative proteomic analysisof different Toxoplasma gondii genotypes by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis combined with mass spectrometry Electrophore-sis，2014; 35( 4) 533 54511Leung SM，Pitts L A novel approach using MALDI-TOF /

4、 TOF massspectrometry and prestructured sample supports ( AnchorChip Technology) for proteomic profiling and protein identification Methods Mol Biol，2008; 441 57 7012Macht M，Asperger A，Deininger SO Comparison of laser-induced dis-sociation and high-energy collision-induced dissociation using matrix-

5、assistedlaserdesorption / ionization tandemtime-of flight ( MALDI-TOF / TOF ) forpeptide and protein identificationapid Commun Mass Spectrom，2004; 18( 18) 2093 210513Cooper B the problem with peptide presumption and low Mascot sco-ringJ Proteome es，2011; 10( 3) 1432 143514Brosch M，Yu L，Hubbard T，et

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7、7 李芳，马风杰，丁绪平 人参总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经血管单元的保护作用 潍坊医学院学报，2014; 36( 1) 76 7918 赖利平，潘伟男，邓水秀 14-3-3 蛋白家族新机制和新功能研究亚太传统医药，2014; 10( 2) 58 59 19 潘伟男，陈临溪 14-3-3 蛋白 中华医药研究杂志，2006; 6 ( 10) 1103 110620 伍家发，吴 乔 14-3-3 蛋白家族的调控机制和生物学功能 中国细胞生物学学报，2005; 27 101 10421 万曦娣，王 枫，黄欧平 14-3-3 蛋白在人类疾病中的研究 南昌大学学报( 医学版) ，2013; 53(

8、4) 92 9522 郑 欣，胡 波，高顺祥，等 生物膜干涉法研究 STX 与适配体间的相互作用 中国生化药物杂志，2014; 9( 34) 17 1923 王 静，张雅雅，刘 涛，等 姜黄素对 Hsp90 的结合及抑制作用 现代肿瘤医学，2015; 23( 1) 32 35esearch of ginseng total saponins pull down the proteins in brainChen Feiyan，Ouyang Liufeng ，Jiang Yucui，Gu Ling，Chen Cuihua，Xu Yan，Zhao Yunan( esearch Center of

9、Basic Medical College，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing210023)Objective: To predict the targets of ginseng total saponin in brain Methods: In this study，We adopt direct affinity pull down the pro-teins in brain which may interact with ginseng saponins Then，the unknown proteins were iden

10、tified using the MALDI-TOF / TOF after the SDS-PAGE gel electrophoresis separation And the direct affinity chromatography using ginseng total saponins as ligands was adopted to dis-cover the protein targets of ginseng saponin in brain，on the other hand to explore whether the direct affinity chromato

11、graphy is feasible for the finding of small molecular targets Using the BLI technique，the affinity between 14-3-3 protein and ginsenosides was determined to further confirm whether 14-3-3 protein has the direct interaction with ginsenosides，and what kind of ginseng saponin individual has the stronge

12、st af-finity with 14-3-3 protein esults: It showed that five predict proteins were acquired by SDS-PAGE and mass spectrometry espectively:the 14-3-3 protein，actin，creatine kinase B，ATP synthetase and unknown proteinKinetics analysis showed that the affinity ( KD) betweenprotopanoxadiol and 14-3-3 pr

13、otein is 7 8 10-4 M Meanwhile，the affinity ( KD)between panaxatriol and 14-3-3 protein is 5 62 10-4 MConclusion: The 14-3-3 protein is one of the targets for brain of ginseng total saponins，and that protopanoxadiol，panaxatriol could be activa-tors of 14-3-3 proteinKey wordsginseng total saponins( 人参

14、皂苷) ; pull down; mass spectrometry; 14-3-3 protein; protopanoxadiol; panaxatriol二氢杨梅素对糖尿病小鼠降糖作用研究*逯凤肖，王恩花，秦湉，郁建平( 贵州大学药学院，贵阳550025)摘 要 目的: 研究藤茶中二氢杨梅素的降糖作用。方法: 一次性尾静脉注射四氧嘧啶( 75mg / kg) 建立糖尿病小鼠模型，以二甲双胍为阳性对照，研究二氢杨梅素对糖尿病小鼠的体重、摄食量、饮水量、空腹血糖、糖耐量、糖原、抗氧化能力、血清胰岛素和胰* 贵州藤茶资源及加工应用示范( 黔科合 NY20113094 号)46中药药理与临床 2

15、016; 32( 3)腺组织的影响。结果: 二氢杨梅素 100、150 mg / kg 对四氧嘧啶致病小鼠能极显著降低血糖; 提高糖尿病小鼠的糖耐量，减少四氧嘧啶对胰岛的损害，促进糖尿病小鼠肝糖原的合成和胰岛素的分泌; 提高糖尿病小鼠的抗氧化能力。结论: 二氢杨梅素对四氧嘧啶糖尿病小鼠有降糖作用，其降糖机制可能是通过提高抗氧化作用减轻四氧嘧啶对肝脏和胰岛 B 细胞的损伤，促进了肝糖原和胰岛素的合成。关键词二氢杨梅素; 糖尿病; 血糖; 糖原; 抗氧化DOI:10.13412/ki.zyyl.2016.03.012二氢杨梅素来源广泛，是藤茶的主要活性成分，藤茶是葡萄科蛇葡萄属的藤本植物，学名为显

16、齿蛇葡萄 ( Ampelopsis grossedentata) ，广泛分布在我国湖北，湖南，贵州，广西等省1，2。前人的研究证明藤茶总黄酮对糖尿病模型具有较好的区3。本研究基于藤茶总黄酮的降糖作用降血糖作用，且毒性小进一步研究二氢杨梅素对糖尿病小鼠血糖的影响。1 材料和方法1 1 试验药物 二氢杨梅素为白色粉末，实验室自制，经HPLC 测定，色谱条件: 色谱柱为 Diamonsil C18 ( 250mm 46mm，5m，Dikma) ; 流动相: 甲醇-0 2% 磷酸水溶液( 25: 75 v /v) ; 流速: 1 0ml / min ; 检测波长: 291 nm; 柱温: 35 ; 进

17、样量: 20l。) ，纯度 95 1% ，临用前用生理盐水配制为所需浓度的; 二氢杨梅素标品 HPLC 98% ，批号: 20120916，上海源叶生物科技有限公司。图 1二氢杨梅素标准品色谱图( 保留时间 3 821min)图 2 二氢杨梅素样品色谱图( 保留时间 3 814min)二甲双胍为北京京丰制药有限公司产品。1 2动物 KM 小鼠，清洁级，雄性，体重 23 25 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许 可证号: SCXK( 黔) 2012-0001。1 3试剂 四氧嘧啶( Alloxan) 为 Sigma 产品。血糖含量测定试剂盒和糖原测定试剂盒为苏州科铭生物技术有限公

18、司产品，胰岛素 ELISA 试剂盒、超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 和谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 测定试剂盒为上海恒远生物科技有限公司产品。1 4 仪器 TU-1901 双光束紫外分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产品。酶标仪为芬兰 Labsystems Multiskan MS 352 型号。日本岛津液相色谱仪( SPD-20A 检测器、LC-20AT二元泵、LCsolution 色谱工作站) 。1 5 方法4，5，雄性小鼠，普通饲料适应性喂养 l参照文献周，随机取出 10 只作为正常对照组，其余小鼠禁食不禁水 12 h 后，一次性尾静脉注射四氧嘧啶 75

19、mg / kg，72 h 后尾静脉取血测小鼠空腹血糖，把血糖值高于 16 7 mmol / L 的小鼠定为糖尿病鼠。糖尿病鼠按血糖值随机分为 5 组: 模型对照组，二氢杨梅素 50、100、150 mg / kg 和二甲双胍 150 mg / kg。分别给予生理盐水，二氢杨梅素和二甲双胍每天灌胃一次，连续 4 周。实验期间，每周测量 1 次小鼠的体重，并观察动物的一般情况，每周末自小鼠尾静脉取血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平，动态观测空腹血糖的变化，最后一周记录小鼠每天的进食量和饮水量。给药第 4 周，进行糖耐量实验: 各实验组小鼠禁食 8 h) 后，以 25 g / kg 剂量灌服葡萄糖，测

20、定给葡萄糖前( 0 h) 及给葡萄糖后0 5 h) ，1 h 和 2 h) 的血糖值，实验结束时摘眼球取血，处死动物后立即解剖取后肢骨骼肌和肝组织，按要求做成匀浆，按试剂盒方法测定肌糖原、肝糖原、SOD、MDA、GSH-Px 和胰岛素，取小鼠胰腺，用 10% 福尔马林溶液固定，做胰腺组织切片，且用 HE 染色，形态观察并计算 4X 视野中胰岛个数。2 结果2 1 二氢杨梅素对糖尿病小鼠体重、摄食量及饮水量的影响由表 1 可知，糖尿病小鼠体重明显下降，灌胃 4 周后，二氢杨梅素各剂量组和二甲双胍都能显著改善糖尿病小鼠体重减轻的现象，其中 100、150 mg / kg 的二氢杨梅素作用极其显著。

21、由表 2 可知，糖尿病小鼠的摄食饮水量明显升高，二氢杨梅素和二甲双胍能明显减少糖尿病小鼠的饮水量，但二氢杨梅素对糖尿病小鼠的摄食量影响不显著，无统计学意义，表明二氢杨梅素对糖尿病小鼠多饮症状有所改善。表 1二氢杨梅素对糖尿病小鼠体重的影响 ( x珋 s，n = 10)组别剂量体重( g)( mg / kg)01234( 周)正常对照29 8 1 431 3 1 334 4 1 136 4 1 440 5 1 2模型对照27 1 1 226 9 0 925 2 1 124 1 0 722 6 0 7二甲双胍15026 7 0 928 0 0 627 8 0 727 9 0 9*26 0 1 1*

22、二氢杨梅素5026 5 0 926 5 1 127 5 1 126 9 1 426 5 1 6*二氢杨梅素10026 7 1 128 0 1 429 2 1 431 0 1 332 7 1 6二氢杨梅素15027 0 0 828 5 0 729 6 0 831 8 0 836 1 0 8与模型对照组比较 *P 0 05， P 0 01( 下同)中药药理与临床 2016; 32( 3)47表 2与糖尿病小鼠摄食量及饮水量的影响 ( x珋 s，n = 10)组别剂量摄食量饮水量( mg / kg)( g / kg / d)( ml / kg / d)正常对照210 5 74232 9 9 6模型对

23、照401 3 11 91108 55二甲双胍150369 4 96*872 5 33 4二氢杨梅素50377 4 87984 5 29 2二氢杨梅素100383 1 62962 2 21 3二氢杨梅素150379 4 10 9967 5 31 32 2二氢杨梅素对糖尿病小鼠血糖和糖耐量的影响由表 3可知，灌胃 1 周后，二氢杨梅素 150 mg / kg 对四氧嘧啶糖尿病小鼠有显著的降糖作用，灌胃 2 周后，二氢杨梅素 150 mg / kg 和二甲双胍均能降低糖尿病小鼠血糖，灌胃 3 4 周后，二氢杨梅素100、150 mg / kg 剂量和二甲双胍均对糖尿病小鼠有极显著的降糖作用。由表 3

24、 和图 1 可知 100、150 mg / kg 二氢杨梅素和二甲双胍均能极显著减少糖耐量曲线下面积，表明一定剂量二氢杨梅素能提高糖尿病小鼠的糖耐量。表 3 二氢杨梅素对糖尿病小鼠空腹血糖及糖耐量的影响 ( x珋 s，n = 10)组别剂量血糖 ( mmol / L)糖耐量( mg / kg)01234( 周)( mmolh / L)正常对照5 24 0 25 03 0 35 10 0 35 47 0 25 25 0 327 08 1 8模型对照25 46 1 130 65 2 129 74 1929 98 0 928 58 1 2108 61 3 1二甲双胍15025 84 1 227 33

25、 1 725 51 17*23 75 1 521 51 1 287 25 2 8二氢杨梅素5025 93 1 228 49 1 627 64 1527 53 1 227 74 1 2109 14 2 4二氢杨梅素10024 77 1 227 05 1 725 67 1623 28 1 321 53 1 892 45 3 6二氢杨梅素15025 68 0 924 97 2 1*25 07 18*21 27 1 418 70 0 881 59 2 8图 3二氢杨梅素对糖尿病小鼠糖耐量的影响2 3二氢杨梅素对糖尿病小鼠肝糖原和肌糖原的影响由表3 可知，糖尿病小鼠的肝糖原和肌糖原均明显减少，二氢杨梅素

26、能促进糖尿病小鼠肝糖原的合成，与模型对照组相比 100 mg / kg 二氢杨梅素效果显著，150 mg / kg 二氢杨梅素效果极显著。对肌糖原有一定的增加作用，但效果不显著。表 4二氢杨梅素对糖尿病小鼠肝糖原和肌糖原的影响 ( x珋 s，n =10)组别剂量肝糖原肌糖原( mg / kg)( mg / g)( mg / g)正常对照10 1 0 51 81 007模型对照7 5 0 41 09 011二甲双胍1508 6 0 4*1 24 007二氢杨梅素507 7 0 31 20 016二氢杨梅素1008 6 0 3*1 21 015二氢杨梅素1509 8 0 31 35 0092 4

27、二氢杨梅素对糖尿病小鼠抗氧化作用的影响由表 5 可知，糖尿病对照组小鼠血清中 SOD 活性有所下降，但与正常组相比无显著差异，MDA 含量极显著升高，GSH-Px 活性高极显著降低，说明糖尿病小鼠血清中自由基产生增加，抗氧化酶活性降低，抗氧化水平降低。灌胃 100、150 mg / kg 二氢杨梅素均能显著减少糖尿病小鼠血清中过氧化物 MDA 含量，增加 GSH-Px 活性，与糖尿病对照组有极显著差异，但二氢杨梅素对糖尿病小鼠血清中 SOD 无显著影响。表 5 二氢杨梅素对糖尿病小鼠血清 SOD、MDA 和 GSH-Px 的影响 ( x珋 s，n = 10)组别剂量SODMDAGSH-Px(

28、mg / kg)( U / ml)( nmol / L)( U / L)正常对照127 2 3 86 7 0 1376 11 413模型对照124 7 2 67 4 0 2322 40 533二甲双胍150125 6 2 67 4 0 2331 20 736二氢杨梅素50126 8 4 37 2 0 2337 78 605二氢杨梅素100125 9 3 76 8 0 2*372 03 614二氢杨梅素150127 0 2 96 7 0 2374 61 592由表 6 可知，糖尿病对照组小鼠肝脏中 SOD 活性明显下降，MDA 含量极显著升高，GSH-Px 活性高极显著降低，说明糖尿病小鼠肝脏的

29、抗氧化水平降低，通过灌胃 100、150 mg / kg 二氢杨梅素能提高糖尿病小鼠肝脏中 SOD 活性，降低 MDA 含量，与糖尿病对照组有极显著差异，但对 GSH-Px 活性无显著影响。 50 mg / kg 二氢杨梅素能增加 GSH-Px 活性，与糖尿病对照组有极显著差异，但对 SOD 活性和 MDA 含量无显著影响。表 6二氢杨梅素对糖尿病小鼠肝脏 SOD、MDA 和 GSH-Px 的影响( x珋 s，n = 10)组别剂量SODMDAGSH-Px( mg / kg)( U / mg)( mmol / g)( U / g)正常对照1 14 0 0376 08 1 635 10 0 04

30、模型对照0 97 0 0387 77 1 514 67 0 08二甲双胍1501 01 0 0382 92 2 094 71 0 06二氢杨梅素501 03 0 0283 77 1 895 02 0 06二氢杨梅素1001 09 0 0277 17 1 954 83 0 09二氢杨梅素1501 09 0 0276 18 1 454 73 0 082 5 二氢杨梅素对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响 二氢杨梅素 100、150 mg / kg 能极显著提高糖尿病小鼠血清中胰岛素含量，50 mg / kg 剂量无明显效果，结果见表 7。表 7二氢杨梅素对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响 ( x珋 s，n =

31、10)组别剂量血清胰岛素( mg / kg)( mIU / L)正常对照7 5 0 1模型对照5 4 0 2二甲双胍1505 2 0 2二氢杨梅素505 4 0 2二氢杨梅素1006 0 0 2二氢杨梅素1506 1 0 248中药药理与临床 2016; 32( 3)2 6二氢杨梅素对糖尿病小鼠胰腺组织病理形态的影响正常小鼠的胰腺中胰岛数目 12 0 个，轮廓清晰，体积较大，呈椭圆形，胰岛细胞排列整齐，无细胞破损现象; 模型对照组小鼠胰腺中胰岛数目 7 0 个，轮廓模糊，无固定形态，胰岛细胞减少且有组织中有水肿; 二甲双胍组小鼠胰腺中的胰岛数目 7 5 个，无固定形态，但相较于模型对照组胰岛中

32、的细胞数目有所增多; 二氢杨梅素 100、150 mg / kg 剂量组小鼠胰腺中胰岛数目 10 5 个，部分胰岛恢复椭圆状，轮廓清晰，细胞排列紧密，但仍有部分胰岛萎缩成无定型状，表明二氢杨梅素能减轻四氧嘧啶对小鼠胰岛的损害。3 讨论四氧嘧啶是特异性的胰岛 B 细胞毒剂，选择性作用于胰岛 B 细胞，通过超氧自由基破坏胰岛 B 细胞，使胰岛 B 细胞分泌6 而长期处于高血糖状态下的小鼠胰岛素减少，产生高血糖由于氧化应激作用，进一步导致小鼠机体抗氧化防御体系的失衡，引发一系列糖尿病并发症。因此小鼠体内抗氧化机制的失7 12衡与糖尿病及其并发症的产生密切相关。增加糖的利用和转化是目前降糖药物降糖的机

33、制之一，其主要是通过促进胰岛素的分泌，增强胰岛素的作用来实现，糖的利用和转化的主4要去向是合成糖原 。因此本实验通过测定抗氧化指标、糖原含量和血清胰岛素含量初步研究二氢杨梅素降糖机制。本实验通过一次性尾静脉注射四氧嘧啶 75 mg / kg 建立的糖尿病模型，成模动物空腹血糖均大于 16 7 mmol / L，且在 4 周内稳定。在以二氢杨梅素 100、150 mg / kg 连续灌胃 4 周后，糖尿病小鼠空腹血糖极显著下降，且 150 mg / kg 剂量组降糖速度比二甲双胍组( 150 mg / kg) 快，并能极显著改善糖尿病小鼠的糖耐量、多饮和体重减轻症状。本实验通过测定血清和肝脏中

34、SOD 活性、MDA 含量和 GSH-Px 活性，结果发现二氢杨梅素100、150 mg / kg 能显著降低血清中 MDA 含量，增强 GSH-Px 活性，提高肝脏中 SOD 活性，降低 MDA 含量。提示二氢杨梅素100、150 mg / kg 均能提高糖尿病小鼠的抗氧化能力。二氢杨梅素 50 mg / kg 能极显著提高肝脏中 GSH-Px 活性，但不能显著降低血糖，提示提高肝脏中 GSH-Px 活性可能与二氢杨梅素的降糖作用无关。此外，二氢杨梅素 100、150 mg / kg 组均能明显促进肝糖原合成，增加血清中胰岛素含量。因此，二氢杨梅素可能是通过提高抗氧化作用减轻四氧嘧啶对肝脏和

35、胰腺的损伤，促进了肝糖原和胰岛素的合成，从而起到降糖作用。参考文献1 中国科学院研究所 中国高等植物图鉴 科学出版社 第一版，1982 353 3542 郑成，陈静，郭丽娜，等 二氢杨梅素的降血糖及保护肾脏损伤效果研究 精细化工，2008; 10( 25) 967 969 3 钟正贤，覃洁萍，周桂芬，等 广西藤茶总黄酮降血糖的实验研究 中国中药杂志，2002; 27( 9) 687 689 4 卢 威 秦晓改，王跃虎，等 二氢杨梅素对四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用研究 中药药理与临床，2011; 27( 4) 15 17 5 张 洁，韩爱萍，丁选胜 淫羊藿总黄酮对四氧嘧啶糖尿病小鼠降糖作用的研

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