乳酸菌的分离、纯化与鉴定

1、乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材：1 .实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溟甲酚绿乙醇溶液（澳甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%L 醇、沙黄）、75%醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼月旨30g香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g;2 .仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH 试纸、酸乳瓶、培养皿（小9 或 612）、试管、300ml 三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500

2、ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml 烧杯。二、实验步骤：1 .培养基配制（BCGBCG牛乳培养基）：（A） 溶液： 取脱脂乳粉 100g,水 500ml,加入 1.6%溟甲酚氯乙醇溶液 1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80c 灭菌 20min; （1.6%溟甲苯酚绿（BCG 乙醇?液用 1.6g 澳甲酚绿加入 20ml 无水乙醇中，再加水至 100ml 制成）（B）溶液：酵母膏 10g,水 500ml,CaCO310g 琼脂 20g,加热溶解，用精密 pH 试纸调节 pH 到 6.8,分装入三角瓶后在 103kPa121C 高压蒸汽灭菌 20Min。以无菌操作趁热将（A

3、）（B）溶液均匀混合。2 .药品配制2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g 溶于 20ml95*醇中）20ml,1%T 酸氨水溶液 80ml。将两液混匀，放置 24 小时后过滤即可。2.2 卢哥氏碘液：碘 1g,碘化钾 2g,蒸储水 300ml。先将碘化钾溶于少量蒸储水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸储水 300ml 即成。2.3 蕃红溶液：番红 2.5g,95%酉 I100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取 20ml 与80ml 蒸储水混匀即可。2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A 液：美蓝 0.3g,95%醇 300ml;B 液：0.01%KOH100ml混合 A 和 B 液

4、即成，按 1:100 稀释即可。2.5 生理盐水：称取 9g 氯化钠，溶解在少量蒸储水中，稀释到 1000 毫升。3 .菌悬液的配制取 1 洁净三角瓶，盛以 225ml 生理盐水；7 只洁净试管，各盛 9ml 的生理盐水；加塞包扎于在 103kPa121c 高压蒸汽灭菌 20Min,得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品 25ml 加入盛有 225ml 无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为 10-1 的样品稀释液；将 7 只装 9ml 生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,再用无菌移液管吸

5、10-1 的菌悬液 1ml 放入依次装有 9ml 无菌水的试管中， 稀释混匀便得到 10-2 稀释液，如此重复依次制得 10-310-7 的稀释液。4.倒平板取无菌平板 12 个，编号标明 10-1、10-5、10-6、10-7 各三套；将经高温消毒的培养基冷却到 50c 左右，按无菌操作法倒 12 只平板，每皿约 15ml;平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。1).分离方法A.平板划线接种环挑取 10-1 菌液， 按无菌操作对标有“10-1”的 3 个平板进行划操作； 划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在 40。叵温培养箱中培养 48 小时。B.平板涂布用三支 1ml 无菌移液管分别吸取 10-5

6、、10-6 和 10-7 的稀释菌悬液各 1ml,对号接种于与之对应的 3 个无菌平板中， 每个平皿放 0.1ml;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上 20Min；然后倒置于 40。叵温箱中培养 48 小时。6.脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉 10 克与蔗糖 5 克，水 95 克（蔗糖与水的比例在1:10 的范围内）的比例配制，装量以试管的 1/3 为宜，115c 灭菌 15min7.菌落观察恒温培养 48 小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约 13mm 园形隆起，表面光滑或

7、稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生 CaCO3 勺溶解圈。 40c 培养 48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。.乳酸菌的分离纯化选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40c 培养 824h 若牛乳出现凝固，无气泡， 显酸性， 涂片镜检细胞杆状或链球状， 革兰氏染色显阳性， 则可将其连续传代 3 次，最终选择出在 36h 能凝固的牛乳管，作菌种待用。.乳酸发酵及检查发酵： 观察 BCGf 养基中乳酸菌菌落特征， 选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，4042C 静止培养。取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐

8、水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染-碘液媒染-乙醇脱色-番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对或短链或长链状。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。第二部分：乳酸菌鉴定一、实验器材.蛋白陈水培养基：蛋白陈 10g,氯化钠 5g，水 1000ml,PH:7.27.4121 摄氏度湿热灭菌 20min.糖发酵培养基：蛋白陈水培养基 1000ml,1.6%溟甲酚紫乙醇溶液 12ml,PH:7.6,另配20%溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10ml.有关试剂1.6%澳甲酚紫乙醇溶液：澳甲酚紫 1

9、.6g 溶于 100ml 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用呷咪试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8g,95%乙醇 760ml,浓盐酸 160ml.10%硫酸，2%高钮酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银 2g,蒸储水 100ml，待硝酸银溶解后，取出 10ml备用，向其余的 90ml 硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。二、鉴定试验.形态和培养特征观察采用牛肉膏蛋白陈培养基，将已纯化后的甘油菌种活化后于 37c 下培养 2024

10、h,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法：涂片固定；草酸钱结晶紫染 1 分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染约 1 分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加 95%酉精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20 秒后水洗，吸去水分；蕃红染色液（稀）染 2 分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。.生长条件试验（1）耐盐性试验（NaCl 浓度:0.85、1.20 和 1.71）（mol/L）;耐酸碱试验（pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6 和 8.7）;（3）温度梯度试验（温度：10C、30C、40C、50C、55C、60c 和 65C）。分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养 48h，记录生

11、长状况。.厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后，用密封带包好放入 CO 邸养箱 37c 培养 2 天后,观察生长情况，生长则为阳性。含硝酸钾的营养肉汤加入 2g 硝酸钾入营养肉汤.生理生化试验过氧化氢酶测定将实验菌接种于 PGYW 养基余面上，37C 培养 20h24h,取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加 3 好一 15%勺过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。蛋白陈、酵母膏、葡萄糖(PGY 培养基：蛋白陈 10g,酵母膏 5g,葡萄糖 1g,蒸储水1L。甲基红(M.R)试验接种实验细菌于 PYG 培养基，于 37c 培养 2 天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶

12、液，如呈红色，表示阳性。呷咪试验.试管标记：取装有蛋白陈水培养基的试管 2 支，分别标记乳酸菌和空白对照。.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置 37 摄氏度恒温箱中培养 2448 小时。).观察记录：在培养基中加入乙醴 12ml,经充分振荡，使呷珠萃取至乙醴中，静置片刻后乙醴层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入 510 滴呷咪试齐 L 如有呷珠存在，乙醴层呈玫瑰色，此为呷珠试验阳性反应，否则为阴性反应。.糖发酵试验.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各 2 支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。.接种培养：以无菌操作分别接

13、种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置 37 摄氏度恒温培养箱中培养 24 小时，观察结果。.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，具反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。.乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约 10ml 于试管中，加入10 蜥酸 1ml,再加 2%(钮酸钾 1ml,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。(6)乙酰甲基甲醇试验(V-P 试验)接种新鲜的实验菌种于培养基中,37c 培养 2 天后,取葡萄糖蛋白陈培养液 1mL 在其中加入 1ml10%的 NaOH 混匀，再加入 34 滴 2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性.(7)明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中，置 37c 培养，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为