鸭脖微生物学检验

1、食品安全检测综合实习实习报告题 目鸭脖微生物学检验姓 名专业班级指导教师中国·武汉二一四 年 六 月目 录项目一 鸭脖菌落总数计数1项目二 鸭脖霉菌、酵母菌计数3项目三 鸭脖大肠菌群计数4项目四 鸭脖金黄色葡萄球菌检验6项目五 鸭脖沙门氏菌检验7项目六 鸭脖志贺氏菌检验10项目七 罐头食品的商业无菌11综合分析12实习心得12项目一 鸭脖菌落总数计数1 引言菌落总数的检测可作为食品被微生物污染程度的标志（或食品清洁状态的标志）；预测食品贮存期限（保质期）；食品中细菌总数还能反映食品的新鲜程度、是否发生变质。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培

2、养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。所检微生物只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。2 仪器和试剂（一）仪器移液管4支（1ml）、试管3支、锥形瓶2个（500ml，250ml）、培养皿8个、无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、玻璃珠、洗耳球（二）试剂 1、平板计数琼脂（PCA）培养基： 将5.0g胰蛋白胨、2.5g酵母浸膏、1.0g葡萄糖、15.0 g琼脂加于1000mL蒸馏水中煮沸溶解，调节pH 7.0±0.2。分装于锥形瓶，121高压灭菌15 min。 2、生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121高压

3、灭菌15 min。3 实验步骤1、取225ml生理盐水于锥形瓶中（少量玻璃珠）；分别取9ml生理盐水于3支试管中。 2、用无菌剪刀剪取25g样品于225ml无菌生理盐水中，震荡摇匀。制成10-1稀释液。 3、反复吹吸后移取1ml 10-1稀释液于9ml无菌盐水中，制成10-2稀释液，同样操作制备10-3稀释液。 4、选择10-1、10-2、10-3三个稀释度的样品稀释液，用无菌移液管先反复吹吸，分别吸取1mL到无菌平皿中，每个稀释度做2个平皿；同时，分别吸取1mL无菌生理盐水到2个平皿中作为空白对照5、熔化培养基及时将已冷却到46左右的培养基倾入到平皿中，并转动平皿使其混合均匀。7、待琼脂凝固

4、后，将平板翻转，36±1培养48 h±2 h8、菌落计数：取菌落数在30 CFU300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。9、菌落计数：若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计

5、算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： 公式（1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板

6、均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。4 实验结果表1 鸭脖菌落总数稀释度10-110-210-3空白菌落数（CFU）00000000平均数0000由表1知，所有稀释度平板菌落总数均为0，则由菌落计数方法知样品的菌落总数为10CFU/g GB2726-2005熟肉制品卫生标准中酱卤肉规定菌落总数80000cfu/g，本样品的菌落总数与国标的相对比，小于国标规定的限值，故本样品符合国标要求。项目二 鸭脖霉菌、酵

7、母菌计数1 引言霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌群的一部分在某些情况下，霉菌和酵母也可造成食品腐败变质。霉菌酵母菌生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于其能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素；霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌之一，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。2 仪器和试剂（一）仪器：移液管4支（1ml）、试

8、管3支、锥形瓶2个（500ml，250ml）、培养皿8个、 无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、玻璃珠、洗耳球（二）试剂：孟加拉红培养基 ：将5.0g蛋白胨、10.0 g葡萄糖、1.0 g磷酸二氢钾、0.5 g硫酸镁（无水）、0.033g孟加拉红、20.0g琼脂加入1000mL蒸馏水中加热溶化，121灭菌20 min。倾注平板前，将0.1g 氯霉素加入培养基中。 3 实验步骤1、根据国标配制孟加拉红培养基。取225ml蒸馏水于锥形瓶中（少量玻璃珠）；9ml蒸馏水于3支试管中，121 高压灭菌20 min。 2、用无菌剪刀剪取25g样品于225ml无菌水中，震荡摇匀。制成10-1稀释液。 3、反复吹吸后移

9、取1ml 10-1稀释液于9ml无菌水中，制成10-2稀释液，同样操作制备10-3稀释液。 4、选择10-1、10-2、10-3三个稀释度的样品稀释液，用无菌移液管先反复吹吸，分别吸取1mL到无菌平皿中，每个稀释度做2个平皿；同时，分别吸取1mL无菌生理盐水到2个平皿中作为空白对照。5、熔化培养基待冷却到46左右将氯霉素加入培养基，震荡摇匀，迅速倾入到平皿中，并转动平皿使其混合均匀。7、待琼脂凝固后，将平板翻转，28±1培养5d8、菌落计数：选取菌落数在10 CFU150 CFU的平板，菌落数应采用两个平板的平均数。9、结果与报告：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍

10、数计算。 若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。4 实验结果 平板上出现点状红色沉淀，没有典型的霉菌酵母菌的菌落特征。表2 霉菌酵母菌菌落计数稀释度10-110-210-3空白菌落数（CFU）6054860000平均数57700 由表2知，应选择10倍稀释度的样品平板计数，则由菌落计数方法知样品的菌落总数为5.7×10

11、2CFU/g 国标中对于酱卤肉的霉菌酵母菌菌落数没有规定。项目三 鸭脖大肠菌群计数1 引言大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能2 仪器和试剂（一）仪器 杜氏小管18个、移液管3支（1ml）、试管18支、锥形瓶1个（500ml）、无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、玻璃珠、洗耳球、接种环（二）试剂 1、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：将20.0g胰蛋白胨、5.0g氯化钠、5.0g乳糖、2.75g磷酸氢二钾、2.75g磷酸二氢钾、0.1g月桂基硫酸钠溶解于10

12、00mL蒸馏水中，调节pH6.8±0.2。分装到9支有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121高压灭菌15min。2、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤： 按照BGLB成品培养基的说明书，配置好培养基，分装到9支有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。3、生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121高压灭菌15 min。3 实验步骤1、制备好培养基和生理盐水，并将225ml生理盐水装于锥形瓶中，取3支试管，分别装9mL生理盐水。2、用无菌剪刀剪取25g样品于225ml无菌盐水中，震荡摇匀。制成10-1稀释液。3、反复吹吸后移取1ml 10-1稀释液于9ml无菌盐水中，制成10-

13、2稀释液，同样操作制备10-3稀释液。4、选择10-1、10-2、10-3三个稀释度的样品液，用无菌移液管分别吸取1mL到LST发酵液试管中，每个稀释度做3个平行（共9管）5、36±1培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6、用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环于BGLB管中，36±1培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。7、根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表，报告样品中大肠菌群MPN值。

14、4 实验结果 表3 大肠菌群结果统计稀释度10-110-210-3LST注：产气 ：未产气 表4 大肠菌群最可能数（MPN）检索表（部分）阳性管数MPN0.10.010.001000<3.00003.0 初发酵的9支试管均未产气，且培养液澄清。经查表4，样品中大肠菌群数<3/g。根据国标规定酱卤肉的大肠菌群要150，故样品符合国家标准。项目四 鸭脖金黄色葡萄球菌检验1 引言 金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。在食品中不允许被检出。 金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。易培养，对营养要求不

15、高，在普通培养基中生长良好。需氧或兼性厌氧。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。能产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，产生凝固。2 仪器和试剂（一）仪器：培养皿2个、移液管（10ml）、移液管3（1ml）、接种环、载玻片、滴管、 无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、试管2支、小试管2支、锥形瓶、显微镜（二）试剂： 1、7.5%氯化钠肉汤：将10.0 g蛋白胨、5.0 g牛肉膏、75 g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH 7.4，分装225m

16、L预锥形瓶中，121高压灭菌15 min。 2、血液琼脂基础：根据说明书，称取相应成品培养基配制血液琼脂基础培养基。 3、脑心浸出液肉汤（BHI）：根据说明书，称取相应成品培养基配制血液琼脂基础培养基。 4、营养琼脂小斜面：将10.0 g蛋白胨、3.0 g牛肉膏、5.0 g氯化钠、溶解于1000 mL蒸馏水内，调节pH至7.27.4。加入15.0 g20.0g琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装试管（10mL），121 高压灭菌15 min。斜面放置3 实验步骤 1、用无菌剪刀剪取25g样品于225ml氯化钠肉汤中，震荡摇匀。36±1培养24 h。 2、熔化血液琼脂基础培养基，待冷却至5

17、0时，无菌操作加入510ml脱纤维羊血，摇匀，倾注平板制作血平板。 3、取氯化钠肉汤中培养物，划线接种到血平板，36±1培养24 h。4、在血平板上挑取菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈的菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5、镜检：在玻片上滴一滴蒸馏水，接种环挑取可疑菌落于水滴中混匀。手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），结晶紫染色1分钟，水洗，碘液染色1分钟，水洗。脱色液约1分钟，不时摇动玻片至无色为止，水洗。加复染液，染30秒，水洗。待干，镜检6、挑取镜检同样的菌落分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜

18、面，36±1培养24 h。7、取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.3 mL，振荡摇匀，置于36±1水浴锅内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，36±1培养48 h，重复试验。4 实验结果 样品培养物在血平板上没有溶血圈，呈圆形、湿润小白色菌落，镜检看到串状革兰氏阳性菌，BHI浑浊，血浆凝固酶阴性。可能不是金黄色葡萄球菌。根据国标，样品符合国家标准。项目五 鸭脖沙门氏菌检验1 引言沙门氏菌属，属于肠杆

19、菌科，革兰氏阴性，需氧，无芽孢，有鞭毛， 目前鉴定出的有近千种。含量少，处于濒死状态，需要进行前增菌（无选择性,恢复活力）和选择性增菌，然后采用选择性培养基，结合生化鉴定和血清学反应，对沙门氏菌进行分离鉴定。沙门氏菌会引起人体伤寒型、败血型、胃肠炎型危害，规定在食品中不允许检出。2 仪器和试剂（一）仪器 锥形瓶（500ml、25ml）、试管3支、培养皿2个、移液管1支（1ml）、接种环、无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、洗耳球（二）试剂 1、缓冲蛋白胨水（BPW）：将10.0 g蛋白胨、5.0 g氯化钠、9.0 g磷酸氢二钠（含12个结晶水）、1.5 g磷酸二氢钾加入1 000 mL蒸馏水中，搅混均匀

20、，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH 7.2±0.2，高压蒸汽灭菌121，15 min。 2、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：根据成品培养基说明书配制SC增菌液10mL于试管中 3、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：根据成品培养基说明书配制XLD培养基于锥形瓶中。 4、三糖铁（TSI）琼脂：根据成品培养基说明书配制TSI培养基于试管中，并摆斜面。 5、赖氨酸脱羧酶生化管、蛋白胨水生化管、硫化氢生化管、尿素生化管3 实验步骤1、根据国标或说明按时间配制所需培养基或斜面，注意灭菌 2、用无菌剪刀剪取25g样品于225ml缓冲蛋白胨水（BPW）培养基中，36±1培养8 h18h

21、。 3、轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL混合物于10mL SC内，36±1增菌24 h。 4、用接种环取1环增菌液，划线接种于XLD琼脂平板。36±1培养24 h 5、在XLD平板上挑取可疑菌落（菌落呈粉红色，带或不带黑色中心；呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；黄色菌落，带或不带黑色中心），斜面穿刺至TSI。于36±1培养24 h，必要时可延长至48h。 6、将同种菌落上接种至赖氨酸脱羧酶，蛋白胨水，硫化氢，尿素，36±1培养24 h 7、结果观察：培养结束后在蛋白胨水中添加一滴靓基质试剂，观察所有现象表5 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖

22、氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂（TSI）赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；：阳性；：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性表6 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢靛基质尿素赖氨酸脱羧酶A1+A2+A3+/注：阳性；阴性；/阳性或阴性8、结果判定：反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表7可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门

23、氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。表7 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表尿素赖氨酸脱羧酶判 定 结 果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）+沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）+沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：表示阳性；表示阴性必要时按表8进行沙门氏菌生化群的鉴别表8 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目卫矛醇山梨醇水杨苷ONPG丙二酸盐KCN注：表示阳性; 表示阴性4 实验结果 沙门氏菌在BPW中出现浑浊，但是接种在XLD平板上没有长出菌落，

24、因而可以判定样品沙门氏菌阴性，即未检出沙门氏菌，符合国标。项目六 鸭脖志贺氏菌检验1 引言 肠杆菌科，革兰氏阴性兼性厌氧菌，短直杆状，无鞭毛，无芽孢，分解葡萄糖，产酸、不产气，不能分解乳糖，不能利用柠檬酸盐。它是肠道致病菌是引起人类细菌性痢疾的病原菌，通称痢疾杆菌。主要通过食品加工、集体食堂和饮食行业的从业人员中痢疾患者或带菌者污染食物，从而导致痢疾的发生，是一种较常见的、危害较大的致病菌。因而食品中不得检出。2 仪器和试剂（一）仪器 接种环、接种针、无菌剪刀、酒精灯、酒精棉、锥形瓶（500ml、25ml）、培养皿2个、试管4支（二）试剂 1、GN增菌液： 将20g胰蛋白胨、1g葡萄糖、2g甘

25、露醇、5g柠檬酸钠、0.5g去氧胆酸钠、4g磷酸氢二钾、1.5g磷酸二氢钾、5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH7.0。分装225mL于锥形瓶中，115高压灭菌15min2、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：根据成品培养基说明书配制XLD培养基于锥形瓶中3、三糖铁（TSI）琼脂：根据成品培养基说明书配制TSI培养基于试管中，并摆斜面。4、葡萄糖半固体发酵管：将1g蛋白胨、0.3g牛肉膏、0.5g氯化钠加入100mL蒸馏水中，调节pH7.4，加入0.3g琼脂，再加入0.0016g溴甲酚紫和1g葡萄糖，分装于小试管，121高压灭菌15min，垂直放置3 实验步骤1、按国标或说明，配制

26、GN增菌液、TSI琼脂斜面、葡萄糖半固体发酵管、XLD琼脂培养基，并按要求灭菌。2、用无菌剪刀剪取25g样品于225mlGN增菌液中，36±1培养68 h 3、熔化XLD培养基倒平板，取增菌液划线分离两个平板。36±1培养1824 h.4、选取XLD上粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐的菌落，接种TSI和葡萄糖半固体，分别接种TSI和葡萄糖半固体各一管，置36±1培养20 h24 h，分别观察结果。5、结果分析：凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无

27、动力的菌株，为可疑菌株，需进行生化试验和血清学分型。4 实验结果 样品在XLD平板上没有长出菌落，因而可表明，样品中没有志贺菌或志贺菌数量少在检出限以下。故样品符合国家标准。项目七 罐头食品的商业无菌1 引言罐头食品的商业无菌是指罐头食品经过适度热灭菌后，不含有致病微生物，也不含有在常温下能在其中繁殖的非致病性微生物。罐藏食品的腐败有化学、物理、生物因素，但主要是微生物腐败。研究罐藏食品的商业无菌，可以检测罐藏食品是否杀菌彻底、是否漏罐。2 仪器和试剂（一）仪器 移液管2支（1ml）、pH计、试管8支、烧杯2个（50ml）、载玻片、显微镜、接种环、镊子、白瓷盘、天平、酒精灯、酒精棉（二）试剂：

28、结晶紫染色液3 实验步骤 1、取两瓶罐头，标记为A和B，分别称重并记录（精确到1g）。 2、将A罐头置于36±1保温箱保温，B罐头置于25冰箱保存作为对照。10d后取出。 3、将A、B取出，擦干净表面并称重。开启前应适当振摇，无菌操作打开包装。 4、在光线充足、空气清洁无异味的检验室中，将样品内容物倾入白色搪瓷盘内，对产品的组织、形态、色泽和气味等进行观察和嗅闻，按压食品检查产品性状，鉴别食品有无腐败变质的迹象，同时观察包装容器内部和外部的情况，并记录。 5、取混匀的液相部分置于烧杯中，将电极插入被测试样液中，并将 pH 计的温度校正器调节到被测液的温度。 如果仪器没有温度校正系统，被测试样液的温度应调到 20±2的范围之内，采用适合于所用 pH 计的步骤进行测定。当读数稳定后，从仪器的标度上直接读出pH，精确到pH0.05单位。同一个制备试样至少进行两次测定。两次测定结果之差应不超过 0.1 pH单位。取两次测定的算术平均值作为结果，报告精确到0.05 pH单位。 6、与冷藏保存对照样品相比，pH相差0.5及以上判为显著差异 7、接种环挑取汤汁涂于载玻片上，用结晶紫染色液进