GnRHa对SD大鼠子宫内膜容受性的影响

1、GnRHa对 SD大鼠子宫内膜容受性的影响目的 : 体外受精 - 胚胎移植 (in vitro fertilization-embryotransfer,IVF-ET)中, 优质的胚胎、接受态子宫内膜和胚胎与内膜发育的同步发育是胚胎成功种植的关键。 冻融胚胎移植周期中 , 在胚胎质量一定的情况下, 改善子宫内膜容受性 , 能改善胚胎种植结局。目前常用的子宫内膜准备方案主要有自然周期、诱导排卵周期及激素替代周期。近年来的研究提示 , 促性腺激素释放激素 (gonadotrophin releasinghormone,Gn RH)不仅合成于中枢神经系统, 通过下丘脑 - 垂体 - 性腺轴(hypo

2、thalamus-pituitary-ovaryaxis,HPO) 作用于卵巢及子宫 , 在卵巢、子宫等外周生殖系统也有合成 , 促性腺激素释放激素受体(gonadotrophin releasinghormone,Gn RHR)在卵巢颗粒细胞及子宫上皮和基质细胞表达也很丰富, 其在子宫内膜的表达在黄体期升高,Gn RH可能从多个层面调节生殖活动, 改善子宫内膜容受性。子宫内膜腺体在胚胎种植过程中发挥着重要作用, 白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)是目前公认的子宫内膜容受性的标志物之一,胞饮突被认为是子宫内膜容受性经典的形态学标志, 它们的出现与子宫内膜

3、的“种植窗期”相吻合 , 子宫内膜腺体在胚胎种植过程中发挥着重要作用。本研究利用雌 (E) 、孕激素 (P) 及促性腺激素释放激素激动剂(Gn RHa)建立 SD大鼠(Spparague-Dawley rats)子宫内膜准备方案模型。分析各方案中大鼠子宫内膜腺体数目、腺体总面积、LIF 表达水平及胞饮突的表达 , 研究 Gn RHa对 SD大鼠子宫内膜容受性的影响。方法:1 SD 大鼠一般状况评估自入组开始 , 密切观察大鼠活动情况, 有无活动增多、 躁动、进食量减少等低雌激素症状。每 4 天称量大鼠体重 , 分析大鼠体重变化 , 计算大鼠进食量。 2 不同方案内膜准备方法 SD大鼠模型的建立

4、实验动物为雌性未孕SD大鼠 , 每日上午 9:00 行阴道细胞涂片检查确定大鼠生殖周期, 超声检测大鼠子宫内膜厚度, 连续观察 2 周期。选 60 只有正常生殖周期的大鼠 , 随机分为四组 , 自然周期组 (nature cycle group,NC group) 、人工周期组 (hormone replacement therapy group,HRT group) 、高剂量 Gn RHa降调节联合人工周期组 (high-dose Gn RHa and hormonereplacement therapy group,HDG-HRT group)、低剂量 Gn RHa降调节联合人工周期组 (

5、low-dose Gn RHa and hormone replacement therapy group,LDG-HRTgroup), 每组 15 只, 各组大鼠周龄及体重无差别。自然周期组大鼠肌肉注射无菌注射用水 0.2m L,28 天后查阴道细胞涂片 , 动情期与雄鼠合笼 , 次晨检出现阴道栓或者记为孕 0 天 ; 人工周期组大鼠肌肉注射无菌注射用水0.2m L,28 天后每日给予补佳乐 0.42mg/kg 灌胃 , 超声监测大鼠子宫内膜厚度, 达到自然周期中动情期大鼠子宫内膜厚度的平均值2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时与成年雄鼠合笼, 次晨检测到阴

6、道栓者记为孕0 天 , 同时加用黄体酮 6mg/kg 肌注 ; 高剂量降调节联合人工周期组、 低剂量降调节联合人工周期组于动情间期给予达菲林0.4mg/kg 、0.2mg/kg 肌肉注射 , 给药 28 天开始给予补佳乐 0.42mg/kg 灌胃 , 超声监测子宫内膜厚度, 根据内膜厚度及阴道细胞学涂片情况调节补佳乐用药时间, 内膜厚度达到自然周期中动情期大鼠子宫内膜厚度的平均值 2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时加用黄体酮 6mg/kg 肌注 , 并与雄鼠交配 , 晨起检出阴道栓者记孕0 天, 各组大鼠均于孕 4 天处死大鼠并取子宫。3 不同内膜准备方案S

7、D大鼠子宫内膜厚度的超声测量运用Philips IU 22多普勒超声仪检测大鼠子宫内膜厚度, 使用 30MHZ高频电子线阵探头进行检测,测量双侧子宫内膜最厚的位置的厚度, 并取平均值。超声检查大鼠子宫内膜厚度的时机为 : 分组前确定大鼠生殖周期时同时测量生殖各周期大鼠子宫内膜厚度 ;NC 组大鼠检测动情间期、 动情期子宫内膜厚度 ;HRT 组自动情间期开始给补佳乐时监测子宫内膜厚度 , 直至达到自然周期动情期水平 2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时给予黄体酮 ,HDG-HRT组、LDG-HRT组降调节 0、7、14、21、28 天测量大鼠子宫内膜厚度, 给补

8、佳乐后每日监测子宫内膜厚度 , 直至达到自然周期动情期水平2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时给予黄体酮转化内膜。4 SD 大鼠子宫内膜容受性指标的分析方法首先, 取各内膜准备方案组中SD大鼠子宫 , 进行 HE染色 , 从低倍至高倍镜观察各组大鼠子宫内膜在光镜下的组织学形态 , 计数各组大鼠子宫横断面中腺体的数目。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统 ( 武汉千屏影像技术有限责任公司) 分析各个标本横断面腺体的总面积。其次 , 用免疫组化 SP法定位大鼠子宫内膜LIF 定位并进行半定量分析 , 每份标本随机选取 5 个视野 , 记录腔上皮及腺上皮

9、细胞染色强度及各强度细胞数所占百分比 , 并用免疫组织化学评分法H-score 法对 LIF 表达量进行半定量分析 , 计算公式为 ?i Pi(10)1(,Pi为阳性细胞百分率 ,i为染色强度 , 以每张切片染色底背景作为对照 , 不显色或显色不清为0 分; 浅黄色为 1 分; 棕黄色为 2 分 ; 深褐色为 3分。第三 , 用 S-3500N 扫描电镜观察大鼠子宫胞饮突表达情况并用胞饮突评分法分析大鼠子宫内膜胞饮突表达量的差异, 具体为 : 扫描电镜下 , 放大 3500 倍, 视野下可观察到的子宫内膜上皮细胞数量为250 个 , 每个标本随机选取50 个视野 ,50个视野内胞饮突的表达数量

10、作为胞饮突评分, 计算各组大鼠胞饮突评分均值;5统计学方法 : 采用 SPSS17.0 统计软件进行数据统计 , 计量资料以均数标准差表示 , 方差齐性检验 , 三组以上采用方差分析 , 组间差异采用 LSD法, 两组数据比较采用 t 检验 , 以0.05 为检验水准 , 当 P<0.05 时 , 差异有统计学意义 ; 当P>0.05 时, 差异无统计学意义。结果 :1 各组 SD大鼠一般状况评估降调节第5 天开始 ,HDG-HRT及 LDG-HRT组大鼠出现躁动 , 进食量减少等低雌激素症状, 毛色晦暗 ; 降调第 14 天 ,HDG-HRT及 LDG-HRT组与自然周期组相比

11、, 进食量减少 , 但无显著区别 (P=0.100,P=0.120),体重略下降 , 无统计学差异 (P=0.140,P=0.130) 。给予雌激素后 , 降调节组大鼠进食量增加 , 体重逐渐上升 , 低雌激素症状消失。处死前 , 各组大鼠体重无明显差异(P=0.100), 进食量差异无统计学意义(P=0.100) 。 2 SD大鼠阴道细胞涂片结果自然周期中大鼠阴道细胞涂片呈周期性变化 , 约 4 天一周期 , 依次为动情前期 , 动情期 , 动情后期 , 动情间期。动情前期 , 持续约 9-18 小时 , 阴道涂片上全部为有核上皮, 偶见少量角化细胞 ; 动情期 , 持续约 1 天 , 阴道

12、涂片显示全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞;动情后期 , 持续约 10-14 小时 , 此期阴道涂片显示为白细胞、 角化细胞及有核上皮均有 ; 动情间期 , 持续约 2-2.5 天 , 此期阴道涂片显示为大量白细胞及少量上皮细胞和黏液。 HRT组大鼠雌激素给药后 , 阴道涂片细胞逐渐变化, 无核上皮逐渐增多 ,直至全部为无核上皮。HDG-HRT组、LDG-HRT组大鼠降调节 5 天后阴道涂片细胞去周期变化, 表现为大量白细胞及少量上皮细胞和黏液, 给予雌激素灌胃给药后逐渐转变有核上皮至全部变为无核上皮。综上所述, 给予雌激素后 ,HRT组、 HDG-HRT组、 LDG-HRT组大鼠阴道细胞涂

13、片逐渐变化, 角化上皮逐渐增多直至全部变为角化上皮, 与动情期阴道细胞学涂片表现一致。3 超声下 SD大鼠子宫内膜厚度3.1 自然周期 SD大鼠生殖周期各期子宫内膜厚度自然周期中大鼠动情周期次序为: 动情前期、动情期、动情后期、 动情间期 ,内膜厚度随动情周期呈周期性变化, 分别为 2.76 0.08mm,2.820.10mm,2.78 0.09mm,2.700.07mm。动情期子宫内膜比动情前期、动情后期、动情间期厚(P=0.000,P=0.009,P=0.000)。动情间期子宫内膜最薄 , 与动情前期相比 , 无统计学差异 (P=0.100); 动情后期子宫内膜厚度大于动情间期(P=0.0

14、00) 。动情前期与动情后期相比, 无显著差异(P=0.160) 。3.2 各内膜准备方案中大鼠子宫内膜厚度降调节组 SD大鼠子宫内膜变化降调节第 1 至 28 天,HDG-HRT组、LDG-HRT组大鼠子宫内膜逐渐变薄, 给药第7 天, 两组大鼠内膜厚度与对照组相比,HDG-HRT组内膜厚度低于 LDG-HRT组, 差异有统计学意义 (1.28 0.05mm,1.53 0.1mm,P=0.000) 。降调节第 14 天、 21 天、28 天, 两组内膜厚度相比 , 差异无统计学意义 (P=0.120,P=0.051,P=0.105)。各组 SD大鼠用药情况 NC组大鼠没有使用外源性激素,HR

15、T组大鼠没有使用降调节药物。以内膜厚度达到大鼠自然周期动情期子宫内膜平均厚度2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时为观察日 , 各组大鼠雌激素用药时间进行比较 ,HRT组、 HDG-HRT组和 LDG-HRT组雌激素用药天数分别为 4 天,10.9 天,9.9 天,HRT组短于 HDG-HRT组和 LDG-HRT组, 差异有统计学意义 (P=0.000,P=0.000),HDG-HRT 组比 LDG-HRT组用药时间长 , 但无明显差别 (P=0.068);HRT 组、 HDG-HRT组和 LDG-HRT组雌激素累计用药量分别为1.68mg,4.59mg,4.1

16、4mg,HRT 组显著低于 HDG-HRT组和 LDG-HRT组(P=0.000,P=0.000),HDG-HRT 组明显高于 LDG-HRT组(P=0.048) 。HRT组、 HDG-HRT组和 LDG-HRT组黄体酮使用天数及剂量相同。内膜转化期各组 SD大鼠子宫内膜厚度NC组大鼠动情期子宫内膜厚度为2.81 0.16mm,HRT组、HDG-HRT组和 LDG-HRT组加用黄体酮日各组子宫内膜厚度依次为2.83 0.2mm,2.83 0.3mm,2.83 0.4mm,各组子宫内膜厚度比较无统计学差异(P=0.110) 。4 SD大鼠子宫内膜容受性指标结果4.1 光镜下各组 SD大鼠子宫内膜

17、组织形态比较 NC组大鼠腺体数目为9.7 1.6, 腺体面积为 1870.07 162.93 m2,HRT组、 HDG-HRT组和 LDG-HRT组腺体数目分别为9.8 1.5,11.1 1.7,10.8 1.4,腺体面积为 1834.87 154.07 m2,2078.76 161.16 m2,2010.88 178.99 m2。HRT组与 NC组腺体数目及面积均无显著差异(P=0.814,P=0.560);HDG-HRT组和 LDG-HRT组与 NC组相比 , 腺体数目 (P=0.016,P=0.049) 及腺体面积(P=0.001,P=0.000) 均明显增大 ;HDG-HRT组和 LD

18、G-HRT组与 HRT组相比 , 腺体数目增多 (P=0.028,P=0.041),腺体面积增大 (P=0.000,P=0.000);HDG-HRT 组与LDG-HRT组之间相比 , 腺体数目及腺体面积均无统计学差异(P=0.638,P=0.600)综合以上数据及光镜下观察子宫内膜形态,HDG-HRT组、LDG-HRT组与 NC组及 HRT组相比 , 腺体数目更多 , 形态不规则 , 腺体分泌空泡明显 , 腺腔分泌物更多 , 间质疏松水肿更加明显。4.2 SD 大鼠子宫内膜 LIF 表达情况 NC组大鼠种植窗期LIF 组织学评分为2.59 0.38,HRT 组、HDG-HRT组和 LDG-HR

19、T组大鼠子宫内膜 LIF 组织学评分分别为 2.58 0.24,2.70 0.42,2.72 0.65,HRT 组 LIF 表达量略低于 NC组, 但两组表达量无统计学差异 (P=0.657) 。HDG-HRT组 LIF 表达量较 LDG-HRT组高 , 但差异无统计学意义 (P=0.460) 。HDG-HRT组、 LDG-HRT组 LIF 表达量显著高于 NC组 (P=0.000,P=0.000) 。HDG-HRT组、 LDG-HRT组 LIF 表达量显著高于 HRT组(P=0.000,P=0.000)4.3 SD大鼠子宫内膜胞饮突形态NC组为发育完全的胞饮突 , 表达明显 , 发育同步 , 大小一致 , 表面光滑 , 其余内膜表面被短小的微绒毛覆盖。HRT组胞饮突为发育中的胞饮突, 发育不同步 , 大小不一致 , 表面不甚光滑 ,余内膜面可见浓密的微绒毛覆盖。HDG-HRT组为发育完全的胞饮突 , 表达明显 , 大小一致 , 发育同步 , 形态饱满 , 表面光滑 , 微绒毛短小。LDG-HRT组胞饮突表达明显 , 发育同步 , 大小一致 , 为发育完全的胞饮突 ,