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文档简介
1、PURB在氨基酸调节BMECs乳合成中的作用和分子机理哺乳动物乳腺组织在哺育下一代时分泌乳汁为其成长提供营养以及免疫保护 , 乳汁中的主要成分包括乳蛋白、 乳脂肪、乳糖等 , 牛乳也是人类生活中必不可少的优质食品。 乳合成相关的信号转导通路、 调控乳合成的关键信号分子及其作用机制是畜牧学亦是生命科学研究的重要内容。PURB是 Pur 蛋白家族中成员 ,Pur 家族蛋白可以形成同型和异型复合物, 并且特异性地以高亲和力结合富含嘌呤的ssDNA(有义或反义 ) 或 RNA。它们优先结合含有 GGN(N不是 G)重复序列。本研究前期发现当蛋氨酸(Met) 刺激时牛乳腺上皮细胞 (BMECs)PURB
2、表达量显著增加 , 提示 PURB作为转录因子可能对BMECs的乳的合成起调控作用。目前,国际上有关 PURB的功能和作用机制的研究较少, 尚无研究揭示 PURB对 BMEC乳合成是否发挥作用。本实验拟揭示 PURB在氨基酸促进 BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子机理。本研究通过组织块法培养和纯化BMECs,得到的原代 BMECs进行传代培养 ,-80 冻存备用。倒置显微镜下观察细胞形态和生长速度, 免疫荧光 (IF) 法鉴定细胞的纯度 :检测细胞中 - 酪蛋白 ( -casein) 和角蛋白 18(Cytokeratin 18)的表达。在培养液中添加 0.6 mmol/L Met或
3、 0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR 和 western blotting实验结果表明 -casein 和 -casein表达量显著提高。脂滴实验结果与甘油三酯(TG) 检测实验表明 ,Met 和 Leu 能够显著促进 BMECs乳脂肪的合成。通过以上实验成功地建立了氨基酸调节乳合成的体外细胞培养模型。qRT-PCR和 western blotting结果表明 PURB蛋白和 mRNA的表达量在 Met和 Leu 作用时显著上升。IF 检测 PURB的亚细胞定位 , 显示 PURB定位在胞核中 ,Met 、Leu 处理增强 PURB在胞核中的定位。这些结果表明 ,Met 和 Leu
4、能够显著促进 BMECs中 PURB的表达和核定位 , 提示在 Met 和 Leu 上调乳蛋白和乳脂肪合成的过程中,PURB可能是一个重要的调节因子。利用重组质粒和siRNA 对 PURB基因进行过表达和干扰。PURB基因过表达时 ,PURB、-casein和 -casein表达量显著提高 ,TG 分泌和脂滴的合成显著提高 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也显著提高 ;PURB基因干扰时 ,PURB、-casein及 -casein 表达量显著降低 ,TG 分泌和脂滴的合成显著降低 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也显著降低。 以上研究结果表明 ,PURB具有正向调节
5、mTOR和 SREBP-1c信号分子从而促进乳蛋白和乳脂肪合成的作用。为了探究 PURB接受 Met 和 Leu 刺激从而调节乳合成的分子机制, 应用 PI3K抑制剂沃曼青 (wortmannin) 抑制 PI3K 信号通路。 Western blotting分析表明PI3K 抑制完全阻断了2 种氨基酸对 PURB表达的促进作用。结果表明 Met 和 Leu 通过 PI3K 途径促进 PURB蛋白表达。为进一步探究 PURB是否介导 Met 和 Leu 调节 mTOR和 SREBP-1c信号分子 , 细胞添加 Met 或 Leu 时同时转染 PURB siRNA。Western blottin
6、g分析表明 PI3K 抑制完全阻断了两种氨基酸对mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平的促进作用。结果表明PURB介导 Met 和 Leu 调节 mTOR和 SREBP-1c信号途径。采用染色质免疫共沉淀 (ChIP)-PCR 和 ChIP-qPCR鉴定 PURB与 mTOR、SREBP-1c基因的启动子 (-1-2 000bp)可能发生结合的位点。结果发现PURB与mTOR、SREBP-1c基因的启动子各存在一个结合位点。ChIP-qPCR结果显示 ,Met 和 Leu 刺激促进 PURB与靶基因启动子的结合。 PURB基因过表达和干扰发现PURB正向调节 mTOR和 SREBP-1c的 mRNA水平。这些实验结果表明Met 和 Leu 刺激 PURB表达并促进与 PURB与 mTOR、SREBP-1c的基因启动子结合 , 启动基因转录。已有研究提示PURB在基因转录中起着关键作用 , 但与许多其他转录因子相比, 国际上发表的结果较少。本研究发现在 BMECs中,PURB是牛乳腺细胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向调控因子。 PURB位于细胞核 , 氨基酸 (Met 和 Leu) 通过 PI3K 信号途径促进 PURB表达。PURB可以与 mTOR和 SREBP-1c基因启动子结合促进其转录,Met 和 Leu 刺激这种结合。 PURB介导 Met 和 L
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