北京大学《药物毒理学》9生殖和发育毒性研究（

1、北京大学公共卫生学院毒理学系吴双生殖和发育毒性研究生殖和发育毒性研究(Reproductive and Developmental (Reproductive and Developmental Toxicity Research )Toxicity Research )生殖毒性与发育毒性2 2n 20世纪50年代日本水俣湾甲基汞中毒引起先天水俣病生殖毒性与发育毒性3 3n 19601962年间 反应停引起先天性短肢畸形生殖毒性与发育毒性4 4n1945年日本广岛和长崎原子弹核辐射：小头畸形、智力低下n1970年发现，母体妊娠18周前服用己烯雌酚，可诱发女性子代阴道和子宫颈透明细胞腺癌n电磁辐

2、射、酒精、桑拿等：近50年来全球男性精子数量和质量下降一半n氨基糖苷类抗生素庆大霉素、卡那霉素：胎儿药毒性耳聋n酒精：面部畸形、精神运动和智力障碍n吸烟：自然流产、低出生体重、学习行为障碍n可卡因：流产、小脑畸形、低出生体重、震颤n视黄酸：面部、四肢、心脏、中枢神经、骨骼畸形n丙戊酸：脊柱裂 以上事件的结局都是后代的畸形吗？生殖毒性与发育毒性5 5普通人群中的普通人群中的妊娠结局妊娠结局（Schardein，1993)妊娠结局妊娠结局占全部妊娠比例（占全部妊娠比例（% %）植入后妊娠丢失等不利结局31重大出生缺陷出生时出生后1年2367小的出生缺陷14低出生体重7一岁前婴儿死亡率1.4神经功能

3、异常1617正常50%生殖毒性与发育毒性6 6出生缺陷出生缺陷=先天畸形？先天畸形？不良妊娠不良妊娠结局结局出生缺陷出生缺陷畸形畸形生殖毒性与发育毒性7 7各种因素引起人类出生缺陷所占的比例各种因素引起人类出生缺陷所占的比例 （Brent & Beckman ，1990) 因素因素占全部因素的比例（占全部因素的比例（% %）遗传1525母体状况4母体感染3由于脐带所致的肢切除等机械问题12化学药物或其他环境因素1未知的病因65生殖毒性与发育毒性8 8对对4100多种重点关注的化学多种重点关注的化学物质进行致畸性测试结物质进行致畸性测试结果果无致畸性66%在一个以上的物种中有致畸性7在大

4、多数受试物种中有致畸性18致畸试验结果不明确9有证据表明能改变人类胚胎发育3540种生殖毒性与发育毒性9 9化学物对生殖发育的损害，只与母体和胚胎有关吗？化学物对生殖发育的损害，只与母体和胚胎有关吗？化学物作用于妊娠前期，可能引起什么？化学物作用于妊娠前期，可能引起什么？答：否。某些化学物还会引起雄性带有致畸因子，引起子代畸形。答：不孕不育。生殖毒性与发育毒性1010生殖毒性和发育毒性生殖毒性和发育毒性外源化学物外源化学物雄性雄性雌性雌性精子异常精子异常不育不育卵子异常卵子异常不孕不孕子代植入后子代植入后妊娠妊娠丢失丢失畸形畸形出生缺陷出生缺陷不良妊娠不良妊娠结局结局生殖毒性与发育毒性1111

5、p 生殖毒性（Reproductive Toxicity）n 外源化学物对生殖过程的不良影响, 主要指对生殖细胞的发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用。n 生殖毒性着重研究外源化学物对亲代的生殖功能的有害作用。生殖毒性与发育毒性1212p 发育毒性（Developmental Toxicity）n 外源化学物对发育过程的不良影响,包括对胚胎发育、胎仔发育及出生幼仔发育的损害作用n 发育毒性着重研究外源化学物对子代的发育过程的有害作用。子代断乳后再暴露于饲料中的化学物，还属于发育毒性吗？子代断乳后再暴露于饲料中的化学物，还属于发育毒性吗？生殖毒性与发育毒性1313p 发育毒

6、性的主要表现n 发育生物体死亡(death of the developing organism)受精卵未发育即死亡胚泡未着床即死亡着床后出生前死亡n 生长改变(altered growth)：生长迟缓，局部可视为畸形n 功能缺陷(functional deficiency)：器官、系统、生化、免疫n 结构异常(structural abnormality)：畸形生殖毒性与发育毒性1414p 生殖与发育毒性的特点n 生殖过程对某些化学物的毒作用更为敏感在成体系统毒性的NOAEL，胚胎即可受到影响。n 损害作用不仅表现在暴露化学物质的机体本身，还可影响其后代子一代不再暴露于化学物，但其交配后所生

7、的子二代也出现与子一代几乎完全相同的畸形。所有的化学物都有第二种特点吗？所有的化学物都有第二种特点吗？生殖毒性与发育毒性1515p 生殖与发育毒性的靶器官n 对性腺的损害影响生殖器官发育成熟，造成性腺组织病理学改变。影响配子的发生、增殖和成熟，使生殖细胞数量减少、功能减退及突变突变。n 胚胎毒性（embryo-fetal toxicity）发育生物体死亡、结构异常、生长发育迟缓、功能缺陷n 胎盘毒性（placental toxicity）己烯雌酚（经胎盘致癌作用）水俣病（甲基汞改变滋养层绒毛膜对不能代谢的氨基酸的摄取）生殖毒性与发育毒性1616p 致畸性（Teratogenicity）n 外源

8、化学物作用于妊娠母体，干扰胚胎及胎儿的正常发育过程，使胎儿出现形态结构及功能异常的性质。p 致畸物（Teratogen）n 是指在出生前暴露可诱发永久性结构异常的物质。生殖毒性与发育毒性1717已知的人类致畸物已知的人类致畸物电离辐射电离辐射感染感染药物和化学品药物和化学品放射治疗风疹反应停二乙基己烯雌酚放射性碘巨细胞病毒感染阿巴克丁敌螨普原子武器单纯性疱疹酒精三氟氯溴乙烷梅毒氨基蝶呤异维A酸弓形体病雄性激素锂代谢失调麻醉剂甲硫咪唑克丁病抗甲状腺药物有机汞化合物糖尿病白消安有机溶剂类苯丙酮酸尿咔吲F因苯妥因男性化肿瘤氯代联苯类腐霉利高温香豆素抗凝剂三甲唿唑烷二酮四环素丙戊酸环磷酰胺生殖毒性与发

9、育毒性1818发育毒性的作用机制（以致畸为例）发育毒性的作用机制（以致畸为例）一般的机制一般的机制潜在活性潜在活性举例举例干扰有丝分裂DNA合成羟基脲，阿糖胞苷，5-氟腺嘧啶染色体不稳定，单链断裂，双链断裂，DNA-蛋白质交联，有丝分裂延迟辐射有丝分裂纺缍体紊乱造成细胞周期阻滞，非整倍体，细胞分裂率改变和及细胞死亡抗管素(antitubulin)剂，如苯并咪唑，氨基甲酸酯，秋水仙素 抑制细胞周期甲基汞改变膜功能信号转导低水平铅，甲基汞改变能源供应改变线粒体功能核黄素缺乏，铁缺乏，苯妥英，氯霉素，苯巴比妥钠，可卡因酶抑制细胞生长和增殖关键性酶抑制氨甲蝶呤，5-氟腺嘧啶，洛伐他丁核酸交互作用干扰正

10、常DNA和RNA合成和功能羟基脲，胞嘧啶，阿拉伯糖苷突变DNA碱基序列的改变电离辐射，烷化剂，芳香胺改变基因表达诱导或抑制转录视黄酸，二嗯英，古柯碱，苯妥英凋亡改变正常凋亡视黄酸，二嗯英，DNA损伤剂生殖毒性与发育毒性1919p 致畸作用的影响因素n 接触致畸原的时间n 接触致畸原的剂量n 物种差异n 母体因素和母体毒性n 其他因素生殖毒性与发育毒性2020n 接触致畸原的时间n 致畸作用关键期（critical period)胚胎发育过程中，易于发生形态结构异常的整个时期。通常略长于胚胎的器官形成期（organogenesis period)。生殖毒性与发育毒性2121n 接触致畸原的时间不

11、同动物胚胎发育时间（妊娠天数）不同动物胚胎发育时间（妊娠天数）物种物种着床着床 器官形成器官形成平均妊娠期平均妊娠期人8-1321-56270大鼠5.5-66-1521-22小鼠4.5-56-1519-20地鼠4.5-54-1416兔76-1832生殖毒性与发育毒性2222n 接触致畸原的时间n 靶窗（Target window)不同器官对致畸作用的特殊敏感期。生殖毒性与发育毒性2323n 接触致畸原的时间胎儿发育过程中对发育缺陷的敏感期胎儿发育过程中对发育缺陷的敏感期生殖毒性与发育毒性2424n 接触致畸原的时间大鼠胚胎各器官的特殊敏感期大鼠胚胎各器官的特殊敏感期致畸试验的染毒时间必须安排在

12、器官形成期致畸试验的染毒时间必须安排在器官形成期生殖毒性与发育毒性2525p 致畸作用的影响因素n 接触致畸原的时间n 接触致畸原的剂量n 物种差异n 母体因素和母体毒性n 其他因素生殖毒性与发育毒性2626n 接触致畸原的剂量剂量增加与毒作用表现的关系剂量增加与毒作用表现的关系致畸作用具有阈剂量致畸作用具有阈剂量生殖毒性与发育毒性2727n 接触致畸原的剂量致畸带越宽，致畸危险性越大还是越小？致畸带越宽，致畸危险性越大还是越小？致畸试验的剂量设计应怎样呢？致畸试验的剂量设计应怎样呢？答：越大。致畸带越宽，就有更广范围的剂量可以在不引起胚胎死亡的情况下导致畸形。答：适中。过低不足以显示致畸性；

13、过高引起大量胚胎死亡，畸胎率反而降低，或母体毒性过强，不能判断是致畸物的作用，还是母体毒性的继发作用。生殖毒性与发育毒性2828p 致畸作用的影响因素n 接触致畸原的时间n 接触致畸原的剂量n 物种差异n 母体因素和母体毒性n 其他因素生殖毒性与发育毒性2929n 物种差异动物胚胎对人致畸物的反应动物胚胎对人致畸物的反应反应停反应停氨基蝶呤氨基蝶呤氨甲喋呤氨甲喋呤甲基汞甲基汞睾丸酮睾丸酮田鼠-+小鼠-+大鼠-+胎鼠+家兔+猫+狗+猪+-猴+-+人+某一化学物在某一物种中是否有致畸性取决于什么？某一化学物在某一物种中是否有致畸性取决于什么？答：取决于化学物能否在这一物种体内转化成具有致畸活性的产

14、物。生殖毒性与发育毒性3030n 物种差异动物实验对动物实验对51种人类潜在发育毒物的预测性种人类潜在发育毒物的预测性() （Schardein等，等，1989) 小鼠大鼠猴兔仓鼠分类一致（%）生长停滞6157653939孕体死亡7571535254畸形7167626565合计9198827785假阳性（%）生长停滞25336198孕体死亡111618100畸形14126715假阴性（%）生长停滞1014293954孕体死亡1412293946畸形1125292922生殖毒性与发育毒性3131p 致畸作用的影响因素n 接触致畸原的时间n 接触致畸原的剂量n 物种差异n 母体因素和母体毒性n 其

15、他因素生殖毒性与发育毒性3232n 母体因素和母体毒性n 母体因素遗传背景、营养状态、疾病状态、应激、年龄、产次、代谢状态、其他暴露n 母体毒性胎盘毒性：体积减少、血流量下降、转运改变、代谢改变母体效应：贫血或毒血症、内分泌紊乱、营养缺乏、 电解质紊乱、酸碱失调、宫内血流量降低、 器官功能改变、乳汁质量数量下降生殖毒性与发育毒性3333p 致畸作用的影响因素n 接触致畸原的时间n 接触致畸原的剂量n 物种差异n 母体因素和母体毒性n 其他因素例如化学物的理化性质、染毒途径等生殖毒性与发育毒性3434p 致畸作用的剂量反应关系一次染毒，剂量水平不导致母体严重毒性，致畸作用及其他胚胎毒性的剂量反应

16、关系三种模式：n 不引起胚胎死亡，导致整窝胚胎畸形高度致畸性n 一窝中胚胎畸形、生长迟缓、死亡共存常见n 只有胚胎死亡和生长迟缓，没有畸形对胚胎致死性，但非致畸物生殖毒性与发育毒性3535n 试验动物：大鼠、小鼠、家兔n 剂量高剂量应在母体中产生轻度的毒性（LD50的1/5-1/3）。中剂量应引起最小的毒作用（LOAEL）低剂量：NOAEL或LD50的1/100-1/30。n 暴露途径与染毒时机：应与人的暴露途径相同。器官形成期。n 对照组阴性对照：溶剂或赋形剂，当溶剂可能有不良影响或与受试物反应时，应再设空白对照组。阳性对照（致畸试验）：乙酰水杨酸、Vit-A等n 结果观察母体观察胎仔检查：

17、 一般检查、外观检查、内脏检查、骨骼检查生殖毒性与发育毒性3636n 观察畸形发生情况生殖毒性与发育毒性3737n 观察畸形发生情况生殖毒性与发育毒性3838n 观察畸形发生情况生殖毒性与发育毒性3939n 观察畸形发生情况生殖毒性与发育毒性4040n 结果评定致畸指数=化合物对雌性动物LD50/最小致畸剂量100强致畸作用）生殖毒性与发育毒性4141n 结果评定致畸化学物的分类（致畸化学物的分类（ILSI）基准基准A A类类B B类类C C类类D D类类最小母体中毒剂量与最小致畸剂量之比值大于1很多大于1，或两剂量间有很大重叠小于1母体中毒时无致畸畸胎率高，与剂量相关高，与剂量有关低，与剂量

18、有关-较低剂量致畸类型有特定的器官系统一般为多发性，也可能有特定的特点无特异性，广泛多样-靶细胞特定细胞特定细胞泛化，非特定细胞不祥安全系数范围400300250100生殖毒性与发育毒性4242n 结果评定妊娠期用药类型（妊娠期用药类型（ICH）人群研究结果动物实验结果+-无可用资料+X或DX或DX或D-BAA或B无可用资料C1BC2A、B、C2：仅在如果明显地需要时，在怀孕期间可使用：仅在如果明显地需要时，在怀孕期间可使用。C1：仅在如果证明可能效益与对胎儿的可能的危险：仅在如果证明可能效益与对胎儿的可能的危险比较是可比较是可 取时取时，在怀孕期间可使用。，在怀孕期间可使用。D：如果在怀孕期

19、间使用，应通知病人对胎儿可能的危害：如果在怀孕期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害。X：在怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用。：在怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用。 生殖毒性与发育毒性4343p OECD和EPA等认可的致畸试验替代方法 ，生殖发育毒性体外预筛试验n 胚胎干细胞试验 (embryonic stem cell test, EST) n 细胞微团(micromass，MM)试验n 哺乳动物全胚胎培养(whole embryo culture, WEC)试验生殖毒性与发育毒性4444n 胚胎干细胞试验 (embryonic stem cell test, EST) 将受试物对干细胞分化的抑

20、制以及成体与胚胎组织对受试物细胞毒性敏感性的差异结合进行研究。试验使用两种小鼠的永生化细胞系：代表胚胎组织的小鼠胚胎干细胞D3和代表成体组织的成纤维细胞3T3。通过比较受试物抑制干细胞分化的浓度和抑制ES细胞以及3T3细胞生长的浓度来评价其胚胎毒性。生殖毒性与发育毒性4545n 胚胎干细胞试验 (embryonic stem cell test, EST) 第0天：未分化的心肌细胞第3-5天：悬滴培养；第10天：分化为可以搏动的心肌细胞团生殖毒性与发育毒性4646n 细胞微团(micromass，MM)培养试验微团培养采用高密度的胚胎原代细胞共培养的方法，能够较好的模拟体内发育过程。在培养过程

21、中，均匀分散的细胞逐渐聚集形成细胞团集落，在此期间细胞对化学毒物的作用非常敏感，毒物可以抑制细胞的增殖和分化，从而使细胞集落和细胞数目减少。通过评价对细胞增殖和分化的影响，探索外源化学物的致畸作用，研究化学物质的致畸机制。生殖毒性与发育毒性4747n 细胞微团(micromass，MM)培养试验 大鼠胚胎中脑细胞微团培养Medium control; Solvent controlMB with 10-8 M BPAMB with 10-4 M BPA生殖毒性与发育毒性4848n 哺乳动物全胚胎培养 (whole embryo culture, WEC)试验日龄的大鼠胚胎在体外培养48h后，其

22、生长发育和形态分化与体内同龄胚胎生长发育和形态分化之间差异无显著性。且此时期的胚胎处于器官形成期，对外源性化学物质极为敏感。培养过程中接触胚胎毒性化学物质可导致胚胎生长发育迟滞或器官畸形的出现。可以通过对器官形成期胚胎器官分化和生长发育的影响来判定化学物质的胚胎毒性和致畸性。生殖毒性与发育毒性4949n 哺乳动物全胚胎培养试验A: ControlB: 40.0 g/ml BPAC: 62.5 g/ml BPAE: 78.1 g/ml BPA生殖毒性与发育毒性5050p ICH(The International Conference on Harmonisation of Technical

23、Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,人用药物注册技术要求国际协调会)指南推荐的生殖发育毒性试验n 三段生殖毒性试验。n 一代或多代生殖毒性试验。生殖毒性与发育毒性5151p 动物选择n 必须以哺乳动物为实验对象。n 首选啮齿类大鼠，因大鼠对化学物的致畸作用反应与人类最为接近。n 在胚体胎体毒性试验（致畸试验）中，要求除啮齿类之外的第二种动物（哺乳动物）进行试验，首选兔，比大鼠更接近人的代谢类型。生殖毒性与发育毒性5252p 受试物暴露n 剂量高剂量应在母体中产生轻度的毒性（LD50的1/5-1/3）。中剂

24、量应引起最小的毒作用（LOAEL）低剂量：NOAEL或LD50的1/100-1/30。n 暴露途径与频率应与人的暴露途径相同。一般一日相同时间染毒一次。n 对照组：阴性对照：溶剂或赋形剂，当溶剂可能有不良影响或与受试物反应时，应再设空白对照组。阳性对照（致畸试验）：乙酰水杨酸、Vit-A等生殖毒性与发育毒性5353p 三段生殖毒性试验n 生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）n 胚体-胎体毒性试验（致畸试验）n 出生前和出生后发育毒性试验（围生期毒性试验）n 主要为发育毒性检测，属于化学物毒理学安全性评价试验四个阶段中的第二阶段。生殖毒性与发育毒性5454p 三段生殖毒性试验一般生殖

25、一般生殖毒性试验毒性试验( (生育力和早期生育力和早期胚胎发育毒性试验胚胎发育毒性试验) )致畸试验致畸试验（胚体（胚体- -胎体毒性试验）胎体毒性试验）围生期毒性试验围生期毒性试验（出生前和（出生前和出生后发育毒性试验出生后发育毒性试验）研研究究目目的的评价在配子发育及着床前期接触化学物，评价在配子发育及着床前期接触化学物，对生育力及早期胚胎发育的影响对生育力及早期胚胎发育的影响评价在致畸敏感期接触化学物，评价在致畸敏感期接触化学物，对动物妊娠、胎体死亡、生长及对动物妊娠、胎体死亡、生长及结构异常的影响结构异常的影响评价母体自着床至断乳期间接触化学评价母体自着床至断乳期间接触化学物，对母鼠妊

26、娠，仔鼠生长发育、形物，对母鼠妊娠，仔鼠生长发育、形态结构及神经行为功能的影响态结构及神经行为功能的影响动物动物至少一种，首选大鼠，也可用小鼠至少一种，首选大鼠，也可用小鼠通常两种，大鼠和家兔通常两种，大鼠和家兔至少一种，首选大鼠，也可用小鼠至少一种，首选大鼠，也可用小鼠染染毒毒期期雄鼠：交配前雄鼠：交配前2828天（精子发生期）天（精子发生期）雌鼠：交配前雌鼠：交配前1414天（卵子发生期）到着床天（卵子发生期）到着床（多数器官形成期）（多数器官形成期）胎鼠器官形成期胎鼠器官形成期大鼠孕大鼠孕6-156-15天天家兔孕家兔孕6-186-18天天从着床至哺乳期终止：从着床至哺乳期终止：妊娠第妊

27、娠第1515天天- -分娩后第分娩后第2121天天 处死处死时间时间雄性：受孕成功后雄性：受孕成功后雌性：孕中期（雌性：孕中期（13-1513-15天）天）分娩前一天分娩前一天大鼠孕第大鼠孕第2020天天家兔孕第家兔孕第2929天天亲代：亲代：F1F1代断乳时代断乳时子代：断乳时子代：断乳时观观察察项项目目亲代动物：一般情况，交配行为，雄鼠精亲代动物：一般情况，交配行为，雄鼠精子检查，雌雄生殖器官病理改变子检查，雌雄生殖器官病理改变孕鼠：受孕率，死胎率孕鼠：受孕率，死胎率胎鼠：活胎率，生存率，外观、内脏畸形胎鼠：活胎率，生存率，外观、内脏畸形等等孕鼠：一般情况，受孕情况，流孕鼠：一般情况，受孕情况，流产、早产情况产、早产情况胎鼠：死亡，外观、内脏及骨骼胎鼠：死亡，外观、内脏及骨骼畸形发生情况畸形发生情况孕鼠一般情况，受孕情况孕鼠一般情况，受孕情况仔鼠：外观畸形、出生及哺育存活率、仔鼠：外观畸形、出生及哺育存活率、断乳时检查内脏畸形、生理发育、神断乳时检查内脏畸形、生理发育、神经行为等经行为等生殖毒性与发育毒性5555p 三段生殖毒性试