植物细胞骨架的光学显微镜观察

1、几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察一、实验目的 学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术二、实验原理 在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与 细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为5 6nm，主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩 功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质静止 的外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有1E的距离，与胞质川流运动无关，主要起保持细胞形状、承当细胞运动和细胞内物质运输 的作用。另外，用秋水仙素与细胞松弛素 B 处理也可产生不同的结果。经 秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰

2、乱，但不影响川流运动，这是与秋水 仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素 B 处理，就可抑制细 胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消 耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。三、实验材料 新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。四、实验器材 相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水 纸，剪刀，滴管，擦镜纸。五、实验药品100 /ml秋水仙素溶液，20旧/ml细胞松弛素Bcytochalasin B，蒸馏水, 香玻油，二甲苯。六、实验步骤1. 取新鲜洋葱鳞茎内表皮约 1cm2 或更小，放在干净的载玻片上， 加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡

3、，即制成水封片。2. 取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通 光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。 须反复调整遮 光板的尺寸以得到最正确效果 。3. 把制成的水封片放在暗视野显微镜下用 10倍物镜观察，可以 看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质 点或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动速度很慢 ，水封片中多加些水会促进这种运动4. 学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有 关操作技术。植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的 掌握细胞染色的根本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的 结构，学会制作永久封片。二、实验原理当用适

4、当浓度的 TritonX 100 处理细胞时，因其非离子型外表活 性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋 白，就不会被 TritonX 100 破坏而保存在细胞中。当用考马斯亮蓝 R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨 架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有 关的蛋白质。考马斯亮蓝 R250 并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨 架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细 而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径 约在 40nm 左右。三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材普通光学

5、显微镜， 50ml 烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子， 染色板，吸水纸，擦镜纸。五、实验药品1M 缓冲液：所含各成分终浓度为 50mmolL 眯唑， 50mmolLKCL, 0.5mmol / LMgCl2, Immol / LEGTA(乙二醇双(a氨基乙基?醚四乙酸)， 0.1mmolL EDTA， lmmolL 巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT) 0 Imol / L HCI 调 pH 到 6.82 0.01mol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.8)用 0.2mol/L 磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法： 0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH

6、2PO45lml3. 1%TrltonX 100,用 M 缓冲液配制。4. 0.2%考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸：水 46.5: 7： 46.5。5. 3%戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8配制6. 50%， 70%， 95%乙醇。7. 叔丁醇8. 正丁醇9. 二甲苯。10. 中性树胶。六、实验步骤1. 撕取洋葱鳞状叶内表皮约 lcm 大小，取假设干片，置于装有 pH 6.8磷酸盐缓冲液的 50ml 烧杯中，用镊子轻按入使其浸没 5min。2. 吸去磷酸盐缓冲液，用 l % TritonX 1 00处理 2030min。3. 吸去TrironX i00液

7、，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。4. 用 3%戊二醛固定 0.5h。5. 再用磷酸盐缓冲液洗 3次，每次 10min。6. 0.2%考马斯亮蓝 R250染色20 30min 在染色板上。7. 用蒸馏水洗 1 2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜 下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。8. 如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的 50ml 烧杯中， 依次用如下试剂处理 ：50%乙醇， 70%乙醇， 95%乙醇， 1/2V 95%乙醇 +1/2V叔丁醇，叔丁醇以上每个步骤反响5 10min或正丁醇，正丁 醇，二甲苯，二甲苯每个步骤5 10min。然后，将样品置于载玻片上 展开，镜

8、检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。叶绿体的别离与荧光观察实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它 沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组 分沉到离心管底部，这样，可粗略地别离叶绿体。三、实验材料 新鲜菠菜叶四、实验器材 组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管， Corex 离心 管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴 管，荧光显微镜。五、实验药品匀浆介质0.25mol/L 蔗糖、0.05mol/L TrisHCi 缓冲液，pH7.4:称取85.55g

9、蔗糖，6.05gTris,溶解在近800ml蒸馏水中，加 入约42. 5ml0.lmol /LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。50蔗糖溶液， 15蔗糖溶液。 0.35M 氯化钠， 0.01吖啶橙六、实验步骤 一叶绿体的密度离心1. 洗净菠菜叶，尽可能使它枯燥，去除叶柄、主脉后，称取5g,剪碎。2. 参加预冷到近0C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎0。3. 捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r/min 离心1min。5. 在 2ml 离心管内依次参加 50蔗糖溶液和 15蔗糖溶液， 注意要用滴管吸取 15蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动

10、 50蔗 糖液面，50%蔗糖溶液加0.9ml ,15%蔗糖溶液加0.5ml。加液完后， 可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。6. 在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁参加0.3ml 上清液。7. 离心 8000r/min， 20min。8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻 轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧 光显微镜观察。二菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加12滴 0.35mol/LNaCl 溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1) 在普通光镜下观察(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片

11、，但滴加12滴0.01 %吖啶橙染液染色 lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。七、实验结果(一) 叶绿体的别离和观察1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看 到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2. 以Olympus荧光显微镜为例，在选用 B?blue?激发滤片、B双向色镜和 0-530 阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧 光。3. 参加吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混 有的细胞核那么发绿色荧光。(二) 菠菜叶手切片观察1在普通光镜下可以看到三种细胞，(1) 表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。(2) 保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形

12、细胞。(3) 叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。2在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度 要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿 体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞 少。3用吖啶橙染色后，叶绿体那么发出桔红色荧光，细胞核可发 绿色荧光，气孔仍为绿色。细胞组分的别离一、实验目的 掌握分级别离方法。二、实验原理 利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级 差速离心的方法，将各组分逐级别离出来。三、实验材料小鼠(30 克)取肝脏四、实验器材同实验七外加 eppendorf

13、管、微量进样器、 tip 头、台式高速冷冻离心机。五、实验药品匀浆介质(0.25mol/L蔗糖+ O. Olmol/LTris-盐酸缓冲液pH7.4),乙醇：冰乙酸(3: 1),生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml， 0.25mol/L 蔗糖溶液中 )。其中0.01mo/LTris 盐酸缓冲液配法：0.lmol/L三羟甲基氨 基甲烷(Tris)10ml, 0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。六、实验步骤1. 低速离心别离细胞核(1) 将饥饿 24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速取出肝组织浸入预冷

14、的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。 ，(2) 称取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次。(3) 将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用 4层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至Corex离心管中，同时制 备l张滤液涂片，做好标记，自然枯燥。(4漓心机上500r/min离心5min(4C )，将上层溶液吸入 2支 eppe ndof管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待别离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理。(5)用 5ml 匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以 1000/min离心10min(4C)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余

15、的沉淀物参加 0.3-0.5ml 匀浆介质， 用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记，自然枯燥。2. 高速离心别离线粒体将步骤l中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以10000/min离心5min，缓缓吸出上清液至另 2 eppendorf管，留 取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。(2) 另 2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r/min 离心5min。(3) 吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。3别离物的鉴定(1) 细胞核。将步骤 l 中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min,吹干，滴姬姆萨染液(原液用1/ 15mol磷酸缓冲液 稀释10 20倍)染色10min,自

16、来水冲洗，吹干，在高倍镜 下比拟观察涂片。(2) 线粒体。在 2张干净载玻片中央各滴 23 滴中性红詹纳斯 绿染液，取步骤 2 高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片 上，染色 30min 后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。 附：更精致的别离方 案将/L蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地参加4.5ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700X g离心10min,得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml 0.25mol/L蔗糖溶液洗2 次，每次1000 X g离心10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集 质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为 1.16的蔗糖溶液中，沿 管壁小

17、心参加已放在离心管中的比重 1.18的蔗糖溶液的上层，经 700 X g离心10mi n,质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。(2)细胞核纯化：将沉淀用 5 倍体积的 0.34mol/L 蔗糖 0.5mol/LMg(Ac)2 溶 液混悬，铺在4倍于核悬液体积的0.88m01/L蔗糖一0.5mol/L Mg(Ac)2溶液之上，1500X g离心20min,沉淀物即为纯化的细胞核。(3) 别离核仁：纯化的细胞核混悬在 2倍体积的0.34mol/L蔗糖一 0.5mol/LMg(Ac) 2溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质 pH 中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于 4倍体积的

18、 0.88mol/ L 蔗糖一0.5mol/ LMg(Ac) 2溶液之上，1700X g 离心 17min。 沉淀物即为核仁，溶液为上清液 I。将上清液I 10000 X g离心lOmin得上清液U和沉淀物，沉淀物以 lOml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗2次，每次10000X g离心10min, 得沉淀物即为纯化的线粒体。上清液U经16 300 X g离心20min得上清液川和沉淀物，沉淀物以10ml预冷的0.25m01/L蔗糖溶液洗；16300X g离心20min，得沉淀 物即为纯化的溶酶体。上清液川经100 000Xg离30min,得沉淀物(为微粒体)和上清 液W,后者再经离心150

19、000X g 3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分 子等。四膜虫纤毛的再生一、背景和原理纤毛和鞭毛是细胞外表的特化结构，具有运动功能。纤毛和鞭毛的结构根本相同。纤毛轴心含有一束“ 9+ 2排列的平行微管，中央微管均为完全微管，外围二联体微管由A , B亚纤维组成，A亚纤维为完全微管， 由13个球形亚基环绕而成， B亚纤维仅由10个亚基构 成，另3个亚基与A亚纤维共用图9-16。连丝蛋白动力蛋白臂於射轴茶L中央单体锻管內貓外周恋联体湮纤錐B亚纤魁E 9-16軒毛第构棋式團歼毛潢切面；徽昔二联体及阳雇结构.微管是由微管蛋白组成的管状结构，对低温、高压和秋水仙素敏感。大多数微管纤维处于动态的组装和去

20、组装状态，这是实现其功能所必需的过程。本实验以Rose nbaum和Carls on 1969的实验为根底，在降低pH和钙离子存在的条件 下通过机械修剪的方法，在膜水平脱去四膜虫的纤毛，剩下肿胀的，不能运动的细胞。在不同的生长温度25C和17 C下观察纤毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微 管亚单位的合成和组装。二、实验目的1 使用相差显微镜和血球计数器；2了解微管组装的根本原理三、教学安排学时数：3- 4小时。四、实验仪器、器材与试剂1材料：梨形四膜虫。2仪器：锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm膜，载玻片，盖玻片，定时器。3试剂：蛋白胨，亚胺

21、环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA ，醋酸钠，氯化钙。五、实验方法与步骤1、 分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25 C和17C培 养。时间2、两瓶培养物分别 800g 离心 10 分钟，重新悬浮于 15 毫升 1%蛋白胨溶液，置于 50 毫升锥形瓶，做好标记。3、准备 2个50毫升锥形瓶，各参加 15毫升 1%蛋白胨溶液； 3个 100毫升锥形瓶，含 20毫升 1%蛋白胨溶液，分别参加 1 0微克/升亚胺环己酮； 50微克/升亚新霉素；参加 2毫 克/升秋水仙碱。4、以下操作在冰浴上进行：1 在零时间，用一个大试管在冰浴上将2.5毫升浓缩的四膜虫悬液生长于25C

22、加至5毫升介质 A 10mMEDTA2Na; 50mM醋酸钠；pH6.0 中，搅拌混匀。230 秒后参加 2.5 毫升预冷的蒸馏水。31 分钟后参加 0.25 毫升预冷的 0.2McaCl 2, parafilm 膜封口，倒转试管使之混合。42 分钟后用装有 19 号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中 修剪掉四膜虫的 纤毛。迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。5 去纤毛后，立即把1毫升去纤毛的细胞加至 20毫升1%蛋白胨溶液，25 C预热的100 毫升锥形瓶中，于 25 C培养并开始实验。5、每隔 10 分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性 motilit

23、y %进行分析。由 于脱纤毛的细胞不能运动， 切记在取样前振荡锥形瓶。 在血细胞计数器上观察， 估计运动细 胞和非运动细胞的数目。 制备快速标本， 在相差显微镜下观察细胞是否肿胀， 有无新生纤毛 等情况。6、 同时对生长于 仃C的四膜虫进行脱纤毛，并同在25C的四膜虫的纤毛再生时间比 较。7、从生长于25C的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别参加亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各参加 1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反响是否发生改变。8、从生长于17C的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别参加亚胺环己酮，新霉素，秋水

24、仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各参加 1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反响是否发生改变。9、 从生长于25C的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。对以下各个瓶中分别 参加1ml脱纤毛细胞：(i) 蛋白胨+ 10用/ml亚胺环己酮(ii) 蛋白胨+ 50 g/ml新霉素(iii) 蛋白胨+ 2mg/ml秋水仙碱(iv) 只含蛋白胨作为对照每隔10分钟从瓶中取样。让实验进行尽可能长的时间，以便观察其反响是否发生改变。记录结果实验结果以能动性()对时间(min)作图表示：(1) 生长于25C和17C的四膜虫；(2) 抑制物对纤毛再生的效应。讨论作

25、为这一实验的引伸，还可以应用更多的抑制物来说明，是否需要生成新的信息性分子，细胞周期中的不同时相是否起重要作用？对抑制物的观察可以时可逆的，因为经过一个时间阶段后，细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。这些实验着眼于纤毛的再生系统，在这些系统中很容易识别出重点。这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提 供资料。六、实验提示与考前须知1梨形四膜虫的纯培养可培养于1%蛋白胨(1 %蛋白胨；0.25%酵母浸膏)，培养液用15磅/时2高压灭菌15分钟。在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术，但在课堂实验时无需应用无菌采样技术。为了获得实验所需数量的培养物，含250ml蛋白胨的500ml锥

26、形瓶在25C可培养1-2天，而在17C需2-3天。这一体积的培养物可用来接种25瓶新的 250ml培养物。2生长的温度很重要；如果四膜虫没有在25C生长至少6天的话，那么再生速率显著延缓。因此，对两种不同生长温度的比拟，形成了本实验中一局部的根底。3.四膜虫的离心必须小心， 因为在减速时细胞容易被漩涡卷起。 如果参加实验的学 生较多，或没有经验，最好在实验时由一位技术员来离心细胞。通常 800g 即可，但也可用 1000g。七、思考题纤毛再生所需的时间，是包括微管蛋白的合成和组装在内的许多过程决定的。培养物原 先生长的温度为什么能影响纤毛再生率？通过抑制物的实验结果，我们能否确定在实验过程中，

27、纤毛再生取决于现存前体库的大小和新蛋白质合成的程度？在较低级的真核细胞中我们 能学到什么有关蛋白质合成的知识？八、推荐阅读Rosenbaum,J.L.and Carlson,K. 1968 Cilia Regeneration in Tetrahymena and itsInhibition by Colchicine , J.cell Biol .,40,415Rosenbaum,J.L.,Moulder, J.E. and Ringo,D.L. 1969 FlagellarElongation andChild,F.M1967FlagellarRegenerationinProtozoan

28、Flagellates ,J.Cell Biol .,34,345Shortening inChlamydomona,sJ.Cell Biol ,41,600植物愈伤组织诱发培养一、实验目的掌握无菌操作进行愈伤组织诱发培养的方法。二、实验原理 植物组织培养和细胞培养是进行植物细胞工程的根底工作。一般认为，分化了的植物根、茎、叶细胞具有全能性，在一定条件下进行离体 培养，给予适宜的营养条件和激素水平，可以脱分化为愈伤组织。利用 愈伤组织可以进行一些生物化学、发育学、遗传学等方面的研究工作， 例如愈伤组织能进一步诱导分化成完整的植株，还可以将愈伤组织进 行单细胞别离，做悬浮培养，筛选各种生化突变型

29、。三、实验材料烟草或迎春花茎段四、实验器材培养皿，烧杯，镊子，剪刀，小三角烧瓶，大三角烧瓶，酒精灯，酒精 棉花，滴管，试剂瓶，滤纸，锡箔纸，超净工作台，植物细胞培养室。 五：实验药品MS固体培养基见附录，加0. 8%琼脂：培养基中加生 长素2.4 D,为脱分化培 养基， 培 养基 中加细胞分裂素 6 一 BA 和生长素NAA，为分化培养基，和其它成分相同。70%乙醇，漂白粉溶液 1片漂白粉片加 300ml 水，无菌水。六：实验步骤1. 培养基的配制： MS 固体培养基灭菌后稍冷，倒入无菌 培养皿分装，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二层牛皮 纸盖上用绳扎紧，灭菌后待用。2. 迎春花枝条，去叶，用水

30、洗茎。洗干净后剪取 5cm 长的 枝条 3段，投入 70%乙醇中浸泡 30秒。再转入漂白粉 溶液，消毒 lmin 。3. 移入超净台，按无菌操作要求将茎段取出置于无菌培养 皿内，用无菌水反复冲洗。再用无菌镊子移入另一培养 皿内，再用无菌水反复冲洗。4. 将茎段剪小，每段约 lcm 长，放入脱分化培养基，每皿6 7段，均匀分散在培养皿中，26 C暗培养34天，观 察有无染菌。5. 挑取无污染茎段，转接入新的脱分化培养基，继续暗培 养7天，可观察到愈伤组织开始生长。6. 如果以无菌烟草为材料，可跳过 2、3 两步，省去消毒、 漂洗过程。直接进入第 5 步。取烟草叶片进培养。培养 7 天检查有无染菌

31、，如有污染再转接一次，继续 暗培养 7 天，在这阶段可以看到叶片细胞脱分化产生愈 伤组织。7. 将烟草愈伤组织转接到细胞分化培养基，照光培养 23 周，可以观察到细胞分化产生新的苗。鼠肾细胞原代培养一、实验目的 了解细胞原代培养的原理和方法，学习细胞消化、细胞计 数、营养液的配制等操作技术，观察原代细胞的形态。二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的器官组织，经消 化，培养成为单个细胞的过程。用胰蛋白酶对组织进行消化获得单 细胞悬液，由细胞悬液定量接种后获得原代细胞培养物。胰蛋白酶 的作用是消化除去细胞间质，蛋白酶液中可添加胶原酶以增加消化 能力。细胞培养是探索细胞生命活动规律一种根

32、本的、十分有效的 实验技术，通过细胞培养可以进行细胞的结构，细胞的生长发育等 等各项研究，目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。三、实验材料 出生后一周左右的乳鼠。四、实验器材 细胞培养箱，离心机，超净工作台。细胞培养皿，滴管， 血球计数板，吸液器，眼科剪刀，镊子，小离心管。五、实验药品RPMl640 培养液，小牛血清，青霉素，链霉素， 025胰 蛋白酶和 01胶原酶，75乙醇，碘酒，乙醚， PBS，EDTA 。 六，实验步骤：1. 按无菌操作技术，消毒超净工作台及双手。2. 用乙醚麻醉法处死小鼠：将乙醚棉球放进烧杯中，然后放入小 鼠， 盖住杯口片刻等小鼠死亡。3. 碘酒消毒腹部皮肤。4. 7

33、5酒精脱碘 2 次，然后进入超净工作台操作。5. 用酒精消毒双手及台面。6. 用第一副眼科镊及眼科剪“工字型剪开皮肤。7. 用第二副眼科剪，剪开拉开腹膜。8推开肠管，在腹后壁找到肾脏，并剪取全肾。将剪刀放入75酒精中浸泡，待用。9. 置肾脏于灭菌的盛有PBS灭菌液的培养皿。直径60mm中洗 两次。夹取肾组织，移至灭菌1.5ml离心管内，将剪刀在无菌 PBS 中洗一下，剪碎肾组织，越碎效果越好。10. 参加0. 25%胰蛋白酶+1%胶原酶lml，混合均匀。11. 37C作用15分钟，每五分钟轻轻弹击。12. 无菌滴管轻轻吹打已消化组织 20次，注意防止液体外溢。13. 1000RPM，离心1分钟

34、，沉淀未消化的组织块和残渣。14. 吸取含有离散细胞的上清液至另一个管内。15. 3000RPM离心2分钟，收集离散细胞。16弃去上清液，参加完全培养液lml，吹打均匀。17吸取l0 d，参加细胞计数板中，进行细胞计数。要求数四个角 的16个小格中细胞数的总和。然后按照以下公式计算细胞密 度。总计数结果*1000*稀释倍数=细胞个数/mL418. 按105细胞/ml，吸取lml细胞加lml培养液，接种到35mm细胞培养皿中。19. 轻轻混匀细胞，置培养皿于 37C, 5%的C02培养箱中，第二天 观察，换培养液，继续培养，第四天观察结果。哺乳动物贴壁细胞的传代培养一、实验目的了解哺乳类动物离体

35、贴壁细胞的培养条件；掌握贴壁培养细胞的 传代技术；观察传代细胞贴壁、生长和繁殖过程中细胞形态变化和形成 单层；掌握细胞培养中一些常用培养基、缓冲液、消化液、抗生素、完全 培养液的配制方法及各种无菌消毒方法；掌握细胞计数方法。二、实验原理要使细胞能在离体条件下存活并代代相传，必须在体外人工模拟 个类似于体内的环境。所要求的这个环境呈液态，它包含有细胞赖以 生存的根本培养基、一定的渗透压和氢离子浓度即pH，要有足够的 空间，能在恒温恒压和无菌的条件下以满足细胞群体增殖和代谢的需 要。离体贴壁培养细胞当群体增殖集合形成单层细胞群体到达饱和密度时，必须进行传代。传代过程是通过胰蛋白酶消化将细胞从培养瓶

36、皿上脱落并分散成单细胞，经过稀释 或不经稀释 从一个容器上转 移到另一个容器并给予新鲜培养液进行再培养。这种传代过程称为传 代培养。三、实验材料贴壁培养细胞株系、CHO、Hela、L929、或其他细胞1-2瓶。四、实验器材 设备：细胞培养箱，电热恒温枯燥箱，高压消毒锅，水浴锅，离心机， 冰箱，无菌室或超净工作台。器具：培养瓶 皿36只，离心管 2只，试管 2只，滴管， 5ml、 1Oml， 移液管各假设干支，血球计数板 1 块，污物缸，橡皮塞，吸液器， pH 试纸， 消毒药棉等高压或高温灭菌备用。五、实验药品RPMI1640培养基，5%NaHC03,小牛血清，青霉素，链霉素，谷氨酰胺，0.25

37、%胰蛋白酶液，0.1%EDTA-Na2液，75%乙醇，HCI，台酚 蓝染色液， NaCl， KCl， Na2HP04， KH2P04。六、实验步骤l. 洗净双手，入无菌室缓冲间穿戴工作服、鞋、帽、口罩后进入无 菌室。2点燃煤气 或酒精灯，用 75%乙醇棉球抹拭双手、操作台表 面、各种试剂瓶口。3. 配制有关溶液 1 RPMll640 培养液：1640粉剂一袋10.4g+ 1 升 millce 水 + 谷氨酰胺 0.3g+NaHCO3 2g,混匀后逐滴参加0.5ml浓HCI到pH6.8,过滤灭菌，分装，-20 C保存。临用时加10%小牛血清和两种抗菌素溶液；最终浓度分别 为1 00单位毫升。2

38、小牛血清灭活：小牛血清溶解后放置 56C, 30min,然 后分装小瓶，-20 C保存。3两种抗菌素 双抗溶液：取青霉素 80万单位和链霉素80万单位，溶于80ml无菌水中，配成每毫升1万单位溶液，4C保 存。4PBS 溶液：NaCI 4g, KCl 0.lg , Na?HPO4无水0.57g或12H2O1.43g, KH2PO4 0.lg,双蒸水 500mlpH7.2, 10 磅 20分钟灭菌，4C保存。50.1% EDTA : lOOmg EDTA + 100ml PBS6胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶+ lOOmlPBS7胰酶消化液：溶液5+6，得到200ml溶液过滤灭菌。8细胞培养液：

39、45ml 1640培养液+ 5ml小牛血清+0.5m1双抗。4消化细胞取接种3-5天形成单层的细胞株，使细胞面朝上，将培养液用 吸管吸去，用1-2滴管PBS洗1-2次，参加2滴管消化液。消化1 2min，待细胞单层上出现透明针尖小孔隙时此时镜检可见成片 层的细胞固缩成圆形，细胞与细胞之间相互接触松散或互不接触，使细胞面朝上，轻轻吸去消化液，丢入废物缸，然后参加2滴管完全培养液，吸打细胞使其成细胞悬液。如果消化过头而细胞已自行脱落时，可加少量血清或完全培养液以中止消化。滴管吸打均匀使成细胞悬液并转移至离心管离心1000r，3 5min?后用完全培养液再悬浮。5. 细胞接种取小型细胞培养瓶1只，然

40、后参加5ml左右培养液，再将上述 细胞悬液等量1: 3或1: 4或不等量根据实验需要接种入内，打匀、 平置、编号，37C培养，隔天观察结果。6. 细胞计数胰酶彻底消化细胞，用4.5ml细胞培养液悬浮细胞后转移到试 管中，加0.5ml台酚蓝染色液，滴管吸打细胞悬液使均匀，吸取细胞悬 液要充满滴管，不能有气泡沿细胞计数板血盖片边沿轻轻滴入计数 板不能有气泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有误，在光学显微镜 10X10下计数按图中四角大方格内细胞总数，按公式计算如下4大格细胞总数*1044求出每ml平均细胞数，乘以稀释倍数为该瓶细胞总数。附录二细胞培养用液-1. 平衡盐液(1) Hank液原液：取 N

41、aCI 80.0g, Na2HPO4 2H2O 0.6g, KCI 4.0g , KH2PO4 0.6g, MgSO4 7H2O 2.0g,葡萄糖 10.0g，无水 CaCb 1.4g, 加水至 1000mI。配制：取Hank原液100ml，加蒸馏水896ml，力卩0.5%酚红4ml，混 匀。分装，包扎，0.0552MPa(8psi)/30min 或-.0689MPa临用前，力卩NaHCO3液调pH至7.2。( 2) D-Hank 液NaCl 8.0g, KCl 0.4g , Na2HPO4 12H2O 0.12g, KH2PO4 0.06g, 葡萄糖1.0g,酚红(1%) 2ml，加三蒸水至1000ml。0.0689MPa (10psi) /10min灭菌，冷却后置4C冰箱保存。( 3) Earle 液原液 A:取 NaCI 68.Og , KCl 4.0g , NaHPQ HO 1.4g，葡萄糖 10.0g ，加水至 500ml。原液 B:取 CaCl2 2.0g , MgSO 7HO 2.0g , 0.5%酚红 4.0ml，力卩 水至 500