游离氨基酸总量的测定

1、植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反响， 产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅 与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗直径 6 厘米 3 个、滤纸适量；20ml刻度试管7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管 架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封试管口 ；吸 水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅含铁丝筐 。三、试剂1. 3% 茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试 剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约 10 天。2. 氰酸盐

2、缓冲液按以下方法配制 ：1NaCN±备液 0.01mol/L 490mg心。2醋酸缓冲液：称360g醋酸钠含三分子结晶水溶于约300ml无氨蒸 馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L。取溶液120ml，用溶液2定容到1L。3. 标准氨基酸精确称取在80°C下烘干的亮氨酸13.1mg或ay mol，或氨基氮7卩g。4. 95% 乙醇；异丙醇分析纯 。四、操作步骤1. 标准曲线的制作取20ml刻度试管18支，按下表1参加各试剂。加完试剂后混匀，在100C水浴中加热12min加热时封口，取出在冷水中迅 速冷却，立即于每管中参加 5ml 95%乙醇，塞好塞子，

3、猛摇试管，使加热时 形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于 570nm 波长下测其光密度以空白管为参比 ，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为 纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片 或其它组织，洗净擦干， 剪碎 混匀，迅速称取0.100.20g视氨基酸含量多少而定，共称3份，分别加 入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞或系上塑料薄膜，置沸水浴 中 20min 以提取游离氨基酸， 到时取出在自来水中冷却， 把上清液滤入 25ml 容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤 并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，

4、摇匀。3. 样品测定 另取 4支洁净枯燥的试管，其中 3支分别参加 0.5ml 提取 液,另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别参加NaCh缓冲液、 水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热 12min，冷却后， 再分别加5ml 95汇醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线 或用回归方程计算 即可求出提取液中氨基酸的浓 度。方法二：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反响， 产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅 与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗直径 6 厘米 3

5、个、滤纸适量； 20ml 刻度试管 7 支；移液管 0.5ml 3 支、 5ml 1 支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封试管口；吸水纸；擦 镜纸适量；电炉；水浴锅含铁丝筐。三、试剂1. 3% 茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中。 此试 剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约 10 天。2. 氰酸盐缓冲液 按以下方法配制：1NaCN 贮备液 0.01mol/L 490mg/L 。2醋酸缓冲液：称 360g 醋酸钠含三分子结晶水溶于约 300ml 无氨 蒸馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L。取溶液1

6、20ml，用溶液2定容到1L。3. 标准氨基酸精确称取在80 °C下烘干的亮氨酸13.1mg或a丙氨酸8.9mg丨溶于10% 的异丙醇中，并在 100ml 容量瓶中用 10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为 1mm ol/L 的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量 无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L ,艮卩1ml含氨基酸0.5卩moj或氨基氮 7 ug4. 95%乙醇；异丙醇分析纯 。四、操作步骤1.标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支，按下表1参加各试剂。加完 试剂后混匀，在100 C水浴中加热12min加热时封口，取出在冷水中迅速冷 却，立即

7、于每管中参加5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的 红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度以空白管为参比，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制 标准曲线，求出直线方程。表1各试管参加试剂量营号I-J衣7LM2茹口16.11碗翼誉警tnl0 I0.50无更応他.酬0l403020.1C0.5酩一靳豔昭円常旳.030550.505勒即三鹅眉嗫畑10.50.5CJ0 JOJ0.C50!OilS2302样品提取 选取有代表性的植物叶片或其它组织，洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.10视氨基酸含量多少而定，共称 3份，分别参加20ml 刻度试

8、管中，再加蒸馏水10ml盖塞或系上塑料薄膜，置沸水浴中20min以 提取游离氨基酸，至叩寸取出在自来水中冷却，把上清液滤入 25ml容量瓶中，之 后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣， 最后定容至刻度，摇匀3样品测定 另取4支洁净枯燥的试管，其中3支分别参加0.5ml提取液, 另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别参加NaCN缓冲液、水合 茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热 12min，冷却后，再分别加 5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长 570nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线或用回归方程计算即可求出提取液中氨基酸的浓 度。4. 计算游离氨基酸含量CxTk14(NH2if式中