结核杆菌对利福平药物的灵敏性实验

1、结核杆菌对利福平药物的灵敏性实睑【摘要】目的分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。方式采纳直接涂片检查法和培育法，对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采纳绝对浓度法的间接法进行耐药性测定。结果131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为(21/131)；培育法共检出阳性标本56例，阳性检出率为(56/131)。比较两种检测方式的阳性检出率，不同有显著性(P<)o培育法高于直接涂片法。将培育阳性标本进行利福平药物灵敏性实验，其中有17株发生耐药，耐药率为(17/56)。结论结核杆菌对利福平的初始耐药率仍处在较

2、高水平，必需进一步增强对耐药结核杆菌的监控。【关键词】结核分枝杆菌福平药敏实验StudyontheprimarydrugresistanceagainstrifampicinfortubercolusisZHANGSheng,CHENSidong,WANGBaoguo,ZHOUYong,ZHOUWeiping(InstituteofDiseasePreventandControlofSonggangofTown,Shenzhen518105;GuangdongCollegePharmacy,Guangzhou,Guangdong510006,China)Abstract:ObjectiveTo

3、studythesituationandtrendofrifampicinresistancefortuberculosisandprovidethebasisfortuberculosispreventionandtreatment.MethodsSputumfluidisexaminedwithdirectsmearandcultureonmodifiedLowenstein-Jensenmediumaftertreatmentwith4%NaOH.Thenthepositivesamplesweresubjectedtosusceptibilitytestingagainstrifamp

4、icinusingabsoluteconcentrationmethod.ResultsThepositiveratewithculturingandsmearingmethodwas%(56/131),andthepositiveratewithdirectsmearingmethod%(21/131).Theprevalencerateofprimarydrugresistancewas%(17/56).ConclusionTherateofprimarydrugagainstrifampicinisstillatahigherlevel.Monitoringoftheresistance

5、oftuberculosisshouldbestrengthened.Keywords:mycobacteriumtuberculosis;rifampicin;drugresistancetest结核病是我国重点操纵的重大疾病之一，也是全世界关注的公共卫生问题和社会问题，世界卫生组织已将结核病作为重点操纵的传染病之一。全世界80%的结核患者散布在22个结核病高负担国家,中国是其中之一，结核患者人数仅次于印度居世界第二位lo可是,近10年来，临床上发觉抗结核药的耐药性对结核病化疗成效的阻碍日趋严峻，尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核医治带来较大的困难。为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为

6、临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。结果报告如下。1材料与方式病例来源2005年11月2006年5月,在广州市白云区某医院、深圳市宝安区某医院检查第一次确诊为肺结核的病人，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝杆菌参考菌株为H37Rv灵敏株,由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。痰液直接涂片检查用接种环取脓性痰液12环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。分枝杆菌培育培育基为酸性罗氏培育基。成份：谷氨酸钠（纯度95%以上）g,KH2P0414g,MgS04-7H20g,枸椽酸镁g,甘油12mL,蒸播水600mL,马铃薯淀粉30g,新鲜鸡卵液100

7、0mL,2%孔雀绿水溶液20mLo制备方式各盐类成份溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，滚水浴煮沸1h呈糊状（不时摇动，防凝块），待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121c高压灭菌的中型试管，每管加培育基约7mL,斜置血清凝固器内12层，斜面高度占试管2/3,90h或851h间歇2次。冷却后，37无菌实验24h。培育基斜面颜色鲜艳，表面滑腻无泡，有必然韧性和酸碱缓冲能力,4保留，1个月内利用。接种方式取痰标本12mL,加入2倍量4%aOH,于室温下放置30min（期间振荡23次）后，取处置消化后痰液mL,无菌操作接种于培育基斜面上，每份标本同时接种2支酸

8、性改良罗氏培育基，放置37恒温箱培育。每周观看1次,记录细菌生长情形，至8周为止。药做实验具体操作参照结核病诊断细菌学查验规程2。药物利福平由美国Sigma公司生产，北京索莱宝科技提供。为纯品，粉剂。培育基改良罗氏培育基。成份：谷氨酸钠（纯度95%以上）g,KH2P04g,MgS04-7H20g,枸椽酸镁g,甘油12mL,蒸储水600mL，马铃薯淀粉30g,新鲜鸡卵液1000粉,2%孔雀绿水溶液20mLo制备方式制备方式同酸性罗氏培育基，只是在培育基制成后分装于中型试管前，按每100mL培育基加入1mL利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。利福平药液配制及稀释利福平药物为纯品

9、，生物效价为1000Ug/mg。参照文献2,配制2个浓度的含药培育基，药物浓度为：50Ug/mL、250Ug/mLo依照痰培育阳性标本例数，每支试管含培育基7mL,计算所需培育基体积。每100mL培育基加入1mL利福平稀释药液。菌悬液的制备及接种方式参照全国临床查验操作规程（第3版）进行。质控每批药敏实验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv）检测含药培育基质量。结果判定对照培育基菌落数必需在200以上且无融合。假设菌落数低于50时，从头做药物灵敏性测定。（-）：培育基斜而上无分枝杆菌菌落生长。（1+）：菌落数约占斜面面积的1/4。(2+)：菌落数约占斜面面积的1/2。(3+)：菌落数约占斜面面

10、积的3/4。(4+)：菌落呈菌苔样生长。菌落数少于20个时，报告菌落数。含药培育基菌落数少于20个时，看成不生长。低浓度含药培育基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。2结果痰涂片情形131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为阳性，阳性率为虬痰培育情形131例标本中，经培育有菌生长且经抗酸染色镜检后，共有56例确信为结核分枝杆菌，阳性检出率为。两种检测方式其阳性检出率比较，不同有显著性(P<)o培育法高于直接涂片法。见表lo表1直接涂片法和培育法检出阳性结果（略）Theresultsofsputumfluid

11、examinationwithdirectsmearandculture与直接涂片法比较：*P<（x2查验）药做实验结果质控H37Rv生长情形：对照培育基为4+,高、低浓度含药培育基均不生长，为灵敏。故所配制的培育基质量合格，能用于药物灵敏性测试。56株痰培育阳性标本中，共有17株显现耐药，总耐药率为,其中，属中度耐药有10株，耐药率为%,属高度耐药有7株，耐药率为。见表2。表256株痰培育阳性标本利福平灵敏性测定结果（略）Theresultsofsusceptibilitytestingagainstrifampicinin56positivesamples3讨论直接涂片检查法

12、和分枝杆菌培育法是结核病实验室诊断中经常使用的2种方式，2种方式的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要阻碍。本研究中培育法阳性检出率高于直接涂片检查法。因此，临床上可将2种方式结合利用，以提高结核菌的阳性检出率。耐药性实验不仅是临床选择和评判化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。我国于2000年开展了第4次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示，利福平耐药的初始耐药率为3,本研究中利福平灵敏性实验初始耐药率为，比全国流行病学调查测出的耐药率要高；与其他省份耐药情形相较，湖北省的研究显示结核杆菌对利福平的初始耐药率为4,福建省的为5,本研究中利福平初始耐药率高于该两省；与广东省内其他城市相较，深圳

13、市利福平初始耐药率为%6,东莞地域为%7,本次药敏实验利福平初始耐药率也均高于两市的研究结果。利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物。专门在短程化疗中起着重要作用。而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担；另一方面扩大耐药性传播的机遇，使得整体人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加。研究说明8,利福平产生耐药性是由于其作用靶分子RXA多聚酶亚单位的编码基因(rpoB)突变所致。由于结核分枝杆菌产生自然耐药变异的频率很低，造成耐药的要紧缘故是医治进程中不合理的联合用药、中断用药、不执

14、行归口治理与医治等。因此，在尔后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治方法，抓好结核病人的发觉、记录、治理和合理医治。坚持在直接面视短程化疗(DOTS)9下,初期、适量、规律、全程、联合应用灵敏药物或抗结核药物复合剂，辅以避免疫剂医治，使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌,使痰菌转阴。关于耐药病例防治，须坚持联合用药的原那么，依照既往用药史和药物灵敏性实验制定个体化医治方案。结核病防治有关部门也应增强对耐药菌株的检测，把握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药。【参考文献】1DONALDAE,HANSLR,THURIDURA,etal.Managementoftuberculosis,agu

15、ideforlowincomecountriesM.TheFifthEdition.Paris:UnionAgainstTuberculosisandLungDisease,2000:3.2中国防瘠协会.结核病诊断细菌学查验规程J.中国防痍杂志,1996,18：28-31.3刘宇红,姜广路,赵立平,等.第四次全国结核病流行病学抽样调查一结核分枝杆菌耐药性分析与评判J.中华结核和呼吸杂志,2002,25(4):224-227.4李国明，吴兴荣，张堤，等.湖北省结核分枝杆菌耐药性监测研究J.中华结核和呼吸杂志,2002,25(12):723-726.5邹盛华，代腊梅,张丽水.1008例初治菌阳肺结核患者的初始耐药情形分析J.海峡预防医学杂志,2004,1