内毒素葡聚糖开展

1、1微生物室新开项目简介微生物室新开项目简介 (1-3)-D-Glucan(1-3)-D-Glucan(葡聚糖葡聚糖) )与与细菌内毒素细菌内毒素2对于侵袭性真菌感染诊断滞后诊断滞后,治疗手段有限治疗手段有限基础疾病基础疾病病死率很高病死率很高念珠菌血症若不治疗死亡率可以达念珠菌血症若不治疗死亡率可以达到到45-76%，侵袭性曲霉病死亡率高侵袭性曲霉病死亡率高达达55-70%3诊断方法显微镜检查显微镜检查培养培养血清学血清学分子生物学分子生物学4镜检和培养方法敏感性低敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。证实深部念

2、珠菌感染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难分定植和感染困难培养时间长培养时间长有些标本采集困难有些标本采集困难5非培养方法优点快速报告结果敏感性提高取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评估6非培养诊断的方法简介真菌细胞壁成分n（1-3） - - D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查n半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) n甘露聚糖(mannan)抗原n隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）真菌特异的代谢产物nD-阿拉伯糖醇真菌 DNA 的检测7

3、深部真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版宿主因素临床特征病原学n真菌镜检n真菌培养n组织病理学检查n血清学检查方法（间接证据）wCSF隐球菌抗原阳性确诊wGM-test, G-test临床诊断Clinical Infectious Diseases 2008; 46Clinical Infectious Diseases 2008; 468(1-3)-D-Glucan(1-3)-D-Glucan(葡聚糖葡聚糖) ) “G” “G”试验试验9b1,6葡聚糖 磷脂双分子层几丁质麦角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteins1,3真菌细胞膜、壁结构真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇羊毛

4、固醇C C1414去甲基化酶去甲基化酶1414位还原和位还原和7 78 8位异构酶位异构酶角鲨烯环氧化酶角鲨烯环氧化酶10(1-3)-(1-3)-b b-D-Glucan-D-Glucan生物活性生物活性(1-3)-(1-3)-b b-D-Glucan-D-Glucan作作为真菌细胞壁成分之为真菌细胞壁成分之一，一旦进入机体后，一，一旦进入机体后，将引起真菌病，严重将引起真菌病，严重时将会引起严重的深时将会引起严重的深部真菌感染疾病，部真菌感染疾病，因因此此, ,深部真菌感染对深部真菌感染对患者的健康与生命构患者的健康与生命构成严重威胁成严重威胁. . 传统检测方法为真菌传统检测方法为真菌培养

5、，一是周期长，培养，一是周期长，二是阳性率特别低二是阳性率特别低主要是抗生素类药物主要是抗生素类药物的滥用所引起的滥用所引起真菌感染出现逐渐上真菌感染出现逐渐上升趋势升趋势11“G”试验缘何而来？试验缘何而来？12比浊法反应机理比浊法反应机理细菌内毒素细菌内毒素 （1-3）b b-D-GlucanLAL-RM(反应物反应物)因子因子C活化因子活化因子C 因子因子B活化因子活化因子B 活化因子活化因子G 因子因子G 凝固酶原凝固酶原 凝固酶凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）定量浊度仪定量浊度仪Turbidimetric technique GEL1314背面观背面观 就

6、像是古代武士的心甲就像是古代武士的心甲腹面观腹面观腹部基本呈六角形，腹部基本呈六角形，还可以看到它发达的附肢还可以看到它发达的附肢 图图2 鲎的外形鲎的外形15已知能与鲎试剂发生反应的物质有已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线反应曲线不一样。内毒素反应曲线为为S型特征曲线，而型特征曲线，而-葡聚糖反应葡聚糖反应曲线为经过曲线为经过0点的斜线。点的斜线。16 内毒素和内毒素和- -葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线17酵母菌、丝状真菌细胞壁成分酵母菌、丝状真菌细胞壁成分不仅检测曲霉菌，还可以检

7、测念珠菌、镰刀不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属菌、毛孢子菌、支顶孢属不能检测：隐球菌和接合菌不能检测：隐球菌和接合菌美国美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册已批准，欧洲部分国家已注册中国中国SFDA已获批准进入临床应用已获批准进入临床应用敏感性、特异性：敏感性、特异性：90左右左右b bD葡聚糖的价值葡聚糖的价值18美国大多数研究限于念珠菌菌血症美国大多数研究限于念珠菌菌血症其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少少假阳性：血液透析假阳性：血液透析(纤维素滤膜）；接受血制纤维素滤膜）；接受血制品治疗（免疫球蛋白）品治疗（免疫

8、球蛋白）抗生素对结果的影响？抗生素对结果的影响？b bD葡聚糖的价值葡聚糖的价值19假阳性问题 污染（无热源的试管、枪头和蒸馏水等）血液透析、腹膜透析纱布或其他医疗物品（外科手术）某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）抗肿瘤多糖（香菇多糖）某些细菌败血症患者（尤其是链球菌败血症）n假阳性与应用内酰胺类抗生素无关对策: 动态监测葡聚糖的变化20b bD葡聚糖（葡聚糖（G试验）的试验）的缺陷缺陷标本采集标本采集不能鉴定何种真菌感染不能鉴定何种真菌感染21b bD葡聚糖参考值葡聚糖参考值健康人：健康人： 20 pg/ml22关于关于G试验试验建议建议G试验临床应用试验临床应用 1明确诊

9、断明确诊断（抗真菌药物治疗前）（抗真菌药物治疗前）2治疗效果监测治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）（抗真菌药物治疗后）3连续连续2次采血进行次采血进行G试验试验23细菌内毒素检测的临床应用细菌内毒素检测的临床应用24内毒素的定义内毒素的定义概念概念 内毒素（内毒素（endotoxin）是革兰氏阴）是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖性细菌细胞壁结构中的脂多糖（Lipopolysaccharide LPS），这），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。出。25内毒素结构内毒素结构LPS由三部分组成：由三部分组成

10、： 1 最外层；特异性多糖菌体多糖最外层；特异性多糖菌体多糖(O抗抗原原) 与细菌侵袭力有关与细菌侵袭力有关 2 中间中间 ： 核心多糖核心多糖 3 内层：内层： 类脂类脂A 对宿主有多种毒害作用而无对宿主有多种毒害作用而无种属特异性种属特异性26内毒素的生物学活性（内毒素的生物学活性（1） 刺激体内单核巨噬细胞系统合成刺激体内单核巨噬细胞系统合成分泌多种细胞因子如：分泌多种细胞因子如：TNF-a、Il-1、IL-6、IL-12等，通过这等，通过这些介质直接或间接发挥局部及全些介质直接或间接发挥局部及全身效应，导致过度的全身炎症反身效应，导致过度的全身炎症反应及组织器官损害。应及组织器官损害。

11、27内毒素的生物学活性（内毒素的生物学活性（2） 1 可与多种组织的实质细胞结合直接可与多种组织的实质细胞结合直接导致细胞损伤。导致细胞损伤。 2 激活凝血、纤溶、补体系统，诱发激活凝血、纤溶、补体系统，诱发 DIC 作用于作用于a受体，促使肾上腺儿茶酚受体，促使肾上腺儿茶酚胺分泌，导致微循环障碍、血浆外胺分泌，导致微循环障碍、血浆外渗，休克。渗，休克。 3 发热、白细胞减少等反应发热、白细胞减少等反应。28参考范围 10pg/ml以下以下 ： 健康人值健康人值 10-20pg/ml ： 病变观察期病变观察期 大于大于20pg/ml ： 内毒素血症内毒素血症或深部真菌感染，或深部真菌感染， 需

12、采用对症治疗。需采用对症治疗。 29细菌内毒素检查法在医院的应用细菌内毒素检查法在医院的应用在医院灭菌制剂检验中应用在医院灭菌制剂检验中应用用于注射器、输液器等医疗器械的用于注射器、输液器等医疗器械的细菌内毒素检测细菌内毒素检测在临床医学研究中应用在临床医学研究中应用30人体血液中细菌内毒素及人体血液中细菌内毒素及(1-3)-(1-3)-b b-D-Glucan-D-Glucan与临床之间的关系与临床之间的关系 通过对机体血液中的细菌内毒素及通过对机体血液中的细菌内毒素及(1-3)-(1-3)-b b-D-Glucan-D-Glucan含量含量测定，可以对革兰氏阴性菌及真菌（深部真菌）所引测定

13、，可以对革兰氏阴性菌及真菌（深部真菌）所引起的内毒素（真菌）败血症、菌血症、术前术后感染起的内毒素（真菌）败血症、菌血症、术前术后感染以及深部真菌感染症状进行诊断：主要表现为以及深部真菌感染症状进行诊断：主要表现为A.某些感染症状的鉴别诊断（某些感染症状的鉴别诊断（G+ 菌菌G-菌真菌菌真菌病毒等）病毒等）B.大多数免疫功能低下患者及不名疾病的早期诊断大多数免疫功能低下患者及不名疾病的早期诊断C.对给药方案提供实验理论数据对给药方案提供实验理论数据D.对给药后的治疗效果以及预后判断具有很大意义。对给药后的治疗效果以及预后判断具有很大意义。31 收费细菌内毒素：细菌内毒素：88元元(1-3)-b b-D-葡聚糖：葡聚糖：176元元32总结BG检测可以早期、快速诊断侵袭性真菌感染，可用于真菌感染早期筛查n适用于念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等n不能