第四章基因工程载体

1、第四章第四章 基因工程载体基因工程载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞的细胞的DNA分子分子叫载体。叫载体。一、一、载体载体 （Vectors）广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。载工具叫载体。（1）具有对受体细胞的）具有对受体细胞的可转移性可转移性，可提高载体导入受体细胞的，可提高载体导入受体细胞的效率。效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的）具有与特定受体细胞相适应的复制原点复制原点或或整合位点整合位点，使得，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。外源基

2、因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。（3）具有）具有多种单一的核酸酶切位点多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点多克隆位点)，可用于外源可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）具有合适的选择标记，便于重组）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害扩散，给人类造成危害2. 基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求3. 载体载体 的种类的种类 基因工程中基因工程中常用常用的载体有的载体有5类：类： 质粒

3、（质粒（plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 来源来源功能功能克隆载体克隆载体: 克隆一个基因或克隆一个基因或DNA片段片段表达载体表达载体: 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、

4、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒（1）分子小：）分子小： 1. 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1500 kb（2）编码基因少：）编码基因少： 23个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。 （3）环形状：）环形状：双链环状双链环状DNA。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是RNA,编码毒性糖蛋白编码毒性糖蛋白）。）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。一些额外的特性（非必须）。（4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（supe

5、r coil）Covalent close circular DNA 线形线形DNA （ linear ，lDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 开环开环DNA（ open circular， ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：型电泳迁移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒）氯化铯密度梯度离心提取质粒超螺旋质粒超螺旋质粒开环和线性质粒开环和线性质粒染色体染色体DNA加入加入EB加入加入

6、EB结合结合EB少少结合结合EB多多紧密密度高紧密密度高松散密度低松散密度低密度梯度离心分离密度梯度离心分离二、质粒的类型二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒接合型质粒:非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移1、依据质粒自身传递的性质分类、依据质粒自身传递的性质分类除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌还带有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转接合转移移的基因。的基因。如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道甚至

7、能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫又叫自我转移型质粒自我转移型质粒。1. 接合型质粒：接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunction）2. 非接合型质粒：非接合型质粒：虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失所必需的遗传信息，但失去了控制去了控制细菌配对细菌配对和和质粒接合转移质粒接合转移的基因，的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种

8、抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（得同样的抗生素抗性性状（resistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。磺胺氨苄青霉素卡那霉素四环素链环素汞盐抗性带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）合合成的基因。成的基因。（2）Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。也可以成为接合型质粒。2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类显性质粒显性质粒:宿主

9、细胞由于含有宿主细胞由于含有质粒而获得新性状质粒而获得新性状隐蔽质粒隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状宿主细胞含有此类质粒而无异样性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状A. 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有13份拷贝。份拷贝。B. 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有，有1060份拷贝。份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小

10、，一般属松弛型）。3、依据质粒的复制特性分类、依据质粒的复制特性分类三、质粒的不亲和性三、质粒的不亲和性亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒。 （攘外必先安内） 不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。但只有一个但

11、只有一个EcoR I切点充当克隆位切点充当克隆位点，点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌质粒的筛选标志是大肠杆菌素素E1（colicin E1）。）。（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗易自发突变出抗colicin E1的细胞的细胞.colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，质粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个正好位于这个基因的内部。基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（）具有复制起点（ORI）

12、2. 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。种抗菌素抗性基因。用来插入外源用来插入外源DNA片段。且插入后不影片段。且插入后不影响复制功能。响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的分子量和较高的拷贝数。3. 构建构建质粒克隆载体的基本原则质粒克隆载体的基本原则A、选用合适的出发质粒。出发质粒（也称为亲本质粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、用于选择标记的基因、

13、克隆位点 B、获得构建质粒克隆载体的元件。 C、组装合适的选择标记基因。 D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量。 E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因 氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）4. 质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：标记：i）氨苄青霉素（）氨苄

14、青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死应，杀死生长的细菌生长的细菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码 -内酰胺酶内酰胺酶，特异地，特异地切割氨苄青霉素的切割氨苄青霉素的 -内酰胺环。内酰胺环。 通过与通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死死。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Cmlr 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉，特异地使氯霉素乙酰化而失活。素乙酰化而失活

15、。a）抑菌原理）抑菌原理a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNA发生错读。发生错读。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Kanr 编码的编码的氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶，对，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。合作用。a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与30S核糖体亚基结合，导致核糖体亚基结合，导致mRNA错译。错译。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Strr 编码一种编码一种氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶对链对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体霉素进行修饰，阻断其与核糖体30

16、S亚亚基结合作用。基结合作用。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通过于通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死死生长的细菌生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。入细菌细胞内。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。营养标记营养标记其他标记：如蓝白斑筛选其他标记：如蓝白斑筛选当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌进入受

17、体菌后，受体菌才能生长。后，受体菌才能生长。不带有不带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受体菌不能在的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。生长。（2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数派生质粒具有高拷贝数的特点。的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数数1000100030

18、003000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生来的载体特点是分子量小，派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNA用。用。（3）失控的质粒载体

19、）失控的质粒载体这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒。质粒。温度低（低于温度低（低于35 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（35 oC）时，拷贝数会很快增）时，拷贝数会很快增加到加到1000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。（4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。标记基因内部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNA无抗菌素抗性无

20、抗菌素抗性正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。选择载体。Direct selection vectorsSmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindKil基因Pkn80（17kb）PKN80质粒带有来自Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，它编码一种kil基因，使Mu噬菌体非溶源菌株致死。 HindIII位点上插入外源DNA H

21、indIII位点无插入外源DNA Kil基因无活性Kil基因有活性Mu噬菌体非溶源菌株致死Mu噬菌体非溶源菌株存活（6） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录录翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。密码、终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵

22、子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的表达载体的结构结构1）普通载体元件）普通载体元件复制起始点复制起始点ORI、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。转录终止信号区。五、经典的大肠杆菌质粒载体五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功

23、地用于克隆实验的大肠杆菌质第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb

24、。（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞个细胞1000-30001000-3000拷贝之多！拷贝之多！ colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因

25、基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫型免疫型（ImmE1+ +）。）。EcoR I（4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。 对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变敏感的细菌群体中自发突变产生抗产生抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（5）ColE1

26、的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1- -插入片段插入片段ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件来源）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（

27、4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Te

28、t中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。 高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。 10kb的的DNA在纯化过程中容易段裂。在纯化过程中容易段裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点。能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可

29、能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片段，既除片段，既除去了去了mob识别位点，又增加质粒的识别位点，又增加质粒的拷贝数。拷贝数。（7）PBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片段（带有氯霉酶切片段（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。 cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造Eco

30、R I 位点位点University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成。属正选择载体。造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基端片段。的氨基端片段。pBR322的的Ampr基因

31、基因（2）长度）长度约约2.7kb（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白（蓝白斑）相结合。斑）相结合。（4）选择标记）选择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个分解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的的物质物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯

32、靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应：显色反应：lacZ的的 肽互补肽互补1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变突变受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺

33、失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解聚体的活性酶，不能分解Xgal 。受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a。pUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它，使它能形成能形成4聚体。又能分解聚体。又能分解Xgal。产生蓝。产生蓝色物质。色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入

34、失活pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位点点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合的合成，但插入外源基因就会阻止成，但插入外源基因就会阻止LacZ的的合成。不能互补。合成。不能互补。 lacZ 5 3 肽移码突变肽移码突变lacZ 5 3 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNAIPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操操纵子的启动转录，使受体菌基因组中纵子的启动转录，使受体菌基因组中的的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DN

35、ADNA后，仍然后，仍然不能产生不能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的 受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷

36、酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶乳糖苷酶的缺的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750

37、bp。 选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序。载体上测序。六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别的两侧分别加了一个噬菌体加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启

38、动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在试管里就可以转录在试管里就可以转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS与与pUC18的完全一样。的完全一样。2. pGEM-4Z：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子的启动子的位置互换位置互换。pGEM-3Z的特点：的特点：（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有人工构建的、具有两种不同复制起点两种不同复制起点

39、和选和选择标记、可以在择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存两种不同的寄主细胞中存活和复制活和复制的质粒载体。的质粒载体。Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（2 2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（3 3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。菌、哺乳动物细胞等）进行基

40、因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。间来回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配

41、和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。粒能正确分配到两个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只，只能以随机分配方式分到子细胞中。能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。在寄主菌

42、细胞分裂的过程中，有一个细在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。质粒的优势群体。3. 分离的不稳定性分离的不稳定性（segregation instability）4. 结构的不稳定性结构的不稳定性（structural instability）寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。或缺失。ISdimer重组重组（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞

43、生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。全相同，称差度。（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，

44、拥有少量拷高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作作用下会发生重组形成用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒。（3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片段的质粒载体普遍含有大分子量插入片段的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。能形成质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。导致质粒失控。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一类细

45、菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性结构：结构： 蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着DNA（双链、单（双链、单链、线性、环状链、线性、环状等）。等）。single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA护套分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬导致细菌细胞解体，释

46、放出大量子代噬菌体。菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌整合到细菌的染色体的染色体DNA中。形成这一过程称为溶中。形成这一过程称为溶源化（源化（lysogenization)。整合到细菌染色体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为称为原原噬菌体噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。，随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)：三、单链噬菌体载体三、单链噬菌体载体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大

47、肠杆菌噬菌体：（2）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA。1. 单链单链DNA噬菌体的特点噬菌体的特点（3）RF DNA和和ssDNA都能都能转染转染感受态感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。大肠杆菌。并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 段的段的单链分子单链分子，便于作探针或测序。，便于作探针或测序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包装限制。）不存在包装限制。RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式在寄主细胞内以高拷贝形式存在。存在。成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13

48、噬菌体只感染噬菌体只感染雄性雄性大肠杆菌。大肠杆菌。 但但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。可以转染雌性大肠杆菌。6407 bp。（2）DNA长度长度（3）DNA提纯提纯（1）寄主）寄主（4）M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的长变慢，约为正常的1/21/23/43/4）M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须性须注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、合成、合成+DNA、翻译形、翻译形成噬菌体蛋白成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细

49、胞挤出寄主细胞+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA每个细胞可以放出约每个细胞可以放出约10001000个个M13M13颗粒！颗粒！M13噬菌体噬菌体包装包装DNA分子的能力可达分子的能力可达M13DNA长度的长度的6倍。倍。（5）没有包装限制）没有包装限制3. M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中只有基因基因组中只有基因II与基因与基因IV之间之间存在一段存在一段507bp的基因间隔区。的基因间隔区。（1）克隆区域的选定）克隆区域的选定 基

50、因间隔区（基因间隔区（intergenic region, IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点。切点。其余其余9个个BsuI限制性位点分布在其它部位。限制性位点分布在其它部位。 酶切位点酶切位点M13J. Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的的复制起复制起点点，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬菌体的活力。噬菌体的活力。在在IG区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。 利用利用 -肽序列中的三个单一酶切位肽序列中的三个单一酶切位点（点（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶

51、切位点）加入酶切位点 在在IG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个M13载体：载体：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各种长度的线性片段各种长度的线性片段（其中应有只在（其中应有只在IGIG上切开的线性上切开的线性全长全长M13M13）E.coli lac基因的基因的Hind II 片段片段(lacI、lacP、lacO、lacZ）连接连接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG区插入区插入lacZ才能存活并才能存活并在在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑（3）M13载体系列载体系列加上常用的酶切位点。加上常用的酶切位点。 M13载体

52、系列的命名载体系列的命名M13mpn n代表系列数字代表系列数字 对对M13mp1的改进的改进B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第16个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个产生了一个EcoR I切点。切点。M13mp2：5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亚硝基脲亚硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-转染转染E.coli。mG与与T配对，复制两次后配对，复制两次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点切点用用EcoRI切切M13mp1M1

53、3mp2选择能切开的选择能切开的 线性分子线性分子再环化再环化M13mp1 对对M13mp2的进一步改进的进一步改进在在M13mp2的的LacZ的的5端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位点（合成的多克隆位点（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同对应有相同MCS的的pUC系列载体：系列载体：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成为成为M13mp系列载体：系列载体：12与与pUC18相同相同（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2）

54、 Xgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链）可以克隆双链DNA分子中的每一条链分子中的每一条链子代子代M13噬菌体中包含的是单连噬菌体中包含的是单连+DNA。MCS+-+-+-编码链编码链非编码链非编码链外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源外源DNA转染转染E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中+ 插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降后，遗传稳定性显著下降 实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp1500bp。虽无包装限制

55、，虽无包装限制，并非无限包装！并非无限包装！5. M13载体的缺点载体的缺点由由质粒载体质粒载体与与单链噬菌体载体单链噬菌体载体的复制起点的复制起点结合而成的新型载体系列。结合而成的新型载体系列。MCS噬菌体噬菌体ori质粒质粒oriAmprlacZ lacI约约3000bp（比（比M13小）小）克隆能力大克隆能力大能插入能插入10kb的外源的外源DNA。两种复制形式两种复制形式分子量小分子量小（1）噬菌粒载体的特点）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链

56、复制，又能在噬菌体内进行单链复制。又能在噬菌体内进行单链复制。（2）常见的噬菌粒载体）常见的噬菌粒载体噬菌粒载噬菌粒载体体质粒部分质粒部分单链噬菌单链噬菌体部分体部分辅助噬菌辅助噬菌体体大肠杆菌大肠杆菌寄主寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101 VXM13M13变异变异株株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/ pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。（3）pUC118/pUC119 构成构成1）M13的基因间隔区（的基因间隔区（IG）2

57、）pUC18/pUC19质粒载体：质粒载体：带有带有M13复制起点。复制起点。质粒复制起点质粒复制起点 Ampr lacZ MCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119 pUC118/119的复制模式的复制模式两种不同的复制模式两种不同的复制模式1）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式受受pUC本身的复制起点（来源于本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。）的控制。每个细胞能达到每个细胞能达到500500个拷贝。个拷贝。来源于来源于M13的复制起点被的复制起点被辅助噬菌体辅助噬菌体的基因的基因II产物控制。产物控制。2）单链滚

58、环噬菌体复制模式）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白外壳蛋白复制蛋白复制蛋白辅助辅助M13包装包装当寄主细胞被当寄主细胞被辅助噬菌体辅助噬菌体M13感染后。感染后。 噬菌粒载体的包装噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体：）辅助噬菌体：自身的自身的复制起点发生了突变复制起点发生了突变，复制效率，复制效率低下，但感染细菌后能表达出低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白外壳蛋白和复制蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。，帮助噬菌粒载体复制。如如M13K07等。等。2）包装：）包装：辅助噬菌体辅助噬菌体外壳蛋白和外壳蛋白和 复制蛋白复制蛋白噬菌粒载体噬菌粒载体ssDNA噬菌体噬菌体（4）pBluescript 噬菌

59、粒载体（噬菌粒载体（pBS）Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。公司发展的一类噬菌粒载体。由由pUC质粒载体、质粒载体、f1噬菌体的复制起点和噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子组成。组成。 特点特点 组成组成MCS两侧分别加上两侧分别加上T3和和T7噬菌体的噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体启动子。加入适当的噬菌体RNA聚聚合酶，就可以定向体外转录。合酶，就可以定向体外转录。1）定向体外转录）定向体外转录2）两种复制模式）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。菌体的形式复制包装。3）选择方便）选择方便有有Amp

60、r和和lacZ，可以进行，可以进行Amp抗性抗性选择和选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。蓝白斑选择。4）插入方便）插入方便18个单一酶切位点的个单一酶切位点的MCSSK：表示：表示lacZ的的转录方向转录方向是沿是沿MCS上的上的 SacI KpnI +（f1+）：单链）：单链复制起始方向复制起始方向背离背离 lacZ，能回收，能回收lacZ的编码链（的编码链（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）相反）-（f1-）：能回收）：能回收lacZ的非编码链（的非编码链（-）1）pBluescrip