分子生物学技术鉴定药材

1、学术讨论 分子生物学技术鉴定药材王建云 熊丽娟1(昆明650011云南省药品检验所;1昆明650011昆明市中医院摘要 目的:介绍分子生物学技术鉴定中药材的研究进展,供药学工作者参考。方法:从DN A提取,D NA的R AP D分析及DN A序列测定三个方面进行综述,讨论了这些方法的优缺点。结果与结论:认为分子生物学技术解决了动物药材鉴定的难题,将是今后中药材真伪鉴定技术发展的新方向。关键词 D N A序列测定;RA P D技术;鉴定药材中药材的真伪优劣直接影响着中药的质量和疗效。为此人们作了大量的研究,建立了一些确实有效的评价药材质量的方法1,其鉴定标准也从最初仅有性状,逐渐增加了显微、理化

2、、色谱、光谱等方法。但是,对一部分药材,仅以上述方法是难以达到鉴定的目的,例如,鹿鞭2、前胡3、木蓝4等。因此人们不断研究更完善、更准确、更具科学性的方法来解决药材鉴定问题。本世纪80年代,分子分类学的问世,把生物分类的手段从形态表征,扩展到了生物的遗传物质DN A。由于同种生物体具相同的DN A系列,不同种生物具不同的D N A系列,这便使人们可依据DN A系列的差异来鉴定生物物种。药材除矿物类外,大多数来源于动物和植物。但由于动植物药材多数是死亡的干燥生物体或生物的组织器官,在生物死亡的过程中,细胞会产生核酸酶大量降解DN A,这给药材D N A的分析带来困难。随着分子生物学技术的飞速发展

3、,特别是微量D NA提取技术57和多聚酶链式反应(polymer ase chain reactio n,P CR技术8的发展,使人们能够从药材中提取微量的DN A进行分析,这就为用D NA分析技术鉴定药材提供了可能。近4年来,这方面的研究集中在药材DN A提取、随机扩增多态DN A(random amplified polym orphic D N A,PA PD和DN A序列测定几个方面,现简述如下。1 药材DNA的提取操作程序1 1 动物药材DN A的提取91 1 1 样品清洗 样品(约0 1g用双蒸水、体积分数为75%和95%的乙醇分别反复冲洗,除去杂质和外源性D N A的污染。1 1

4、2 样品的消化加600 l ST E液提取缓冲液(0 1 mo l L-1N aCl;10mmol L-1T ris-HCl;100m mol L-1 ED T A;pH8 0;1/10体积的100g L-1十二烷基磺酸钠(SDS液和蛋白酶K(终浓度200 g ml-1,将样品剪碎,置56 温浴过夜(不时振摇至溶液澄清。如果样品中有骨质原,需加入0 5mg ml-1胶原酶。1 1 3 D N A抽提及沉淀:样品液中加入等体积苯酚液(以1m mol L-1T r is-H Cl,pH8 0饱和,振摇24h, 8000r min-1,离心10min;取上清液加入等体积的苯酚-氯仿(1 1振摇12h

5、,8000r min-1,离心10min;取上清液加等体积的氯仿-异戊醇(24 1振摇8h,8000r min-1,离心10m in;取上清液加1/10体积的10mol L-1N H4A c和无水乙醇,摇匀,-20 放置过夜;8000r min-1离心2min,弃上清液,沉淀置37 中干燥,加适量T E液(10mmol L-1T r is-H CL,1mmo l L-1ED T A, pH8 0溶解后,置4 保存,作为PCR扩增模板D N A 备用。1 2 植物药材DN A提取101 2 1 样品清洗:同动物药材DN A提取的方法。1 2 2 样品消化:样品粉末(约0 1g中加入600 lCT

6、 A B提取缓冲液0 7mol L-1N aCl,50m mol L-1T r-i H Cl;pH8 0;10mmo l L-1EDT A;10g L-1十六烷基三甲基溴化铵(CT A B;1 4巯基乙醇混匀,56 温浴,不时振摇至样品溶解。1 2 3 DN A抽提及沉淀:同动物药材DN A提取。2 DNA序列测定鉴定药材的方法2 1 操作程序本方法是将从药材中所提取的微量的DN A,经P CR扩增,回收扩增产物作为模板,采用双脱氧法测定模板D NA的序列,将所测序列与已知的该物种的D N A序列(对照序列进行比较,如果模板DN A序列与对照序列吻合,则该药材是该物种的组织器官加工的药材。反之

7、,如果模板序列与对照序列不同,则该药材不是该物种加工的药材,为伪品。采用同一样本(或个体多点取样的方法,就可排除药材掺伪带来的误757中国药学杂志1998年12月第33卷第12期Ch in Ph ar m J,1998Decem ber,Vol.33N o.12差。如果每个部位所提D NA序列均一致并与对照序列吻合,则药材是正品并且没有掺伪:反之,如果其中一个部位的序列与对照序列不一致,则样品掺伪。2 1 1 P CR扩增原理 在适量P CR缓冲液中加入微量模板(药材D NA,4种脱氧单核苷酸(dN T P溶液、耐热性多聚酶(T a q酶、M g2+和一对合成DN A的引物。将上述混合液加热,

8、使模板DN A在高温(如95 变性,双链解链,然后降低溶液温度(如37 ,使引物与模板D N A互补退火,形成部分的双链,将溶液温度升至中温(如72 在T a q多聚酶的作用下,以dN T P 为原料以引物为复制的起点,模板DN A的一条双链在解链和退火之后延伸成为两条双链。如此重复改变反应温度,即高温变性,低温退火和中温延伸3个阶段,每改变3次温度为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大1倍,经数十次(如3040循环,最终使基因放大数百万倍。P CR扩增D N A特定区段,是由1对合成的寡核苷酸引物所决定。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,紫外灯下肉眼能见到扩增特异区段的DN A带

9、。2 1 2 双脱氧法测定DN A序列11的原理 利用2 ,3 -ddN T P(2 ,3 -双脱氧核苷酸来终止DN A的复制反应。在D N A复制过程中,T aq酶催化多核苷酸链的延伸,dN T P是接在延伸链的3 -OH上。当掺入2 ,3 -ddN T P时,延伸反应即告终止。这样设计4组反应,每组反应都含有正常的dN T P(其中1种以35S或荧光素标记、单链D N A模板(待测D NA和引物,每组反应中各加入1种2 ,3 -ddN T P和T aq酶。反应结果,如在加入2 ,3 -ddA T P的反应中,凡需要dAT P时,链延伸即在此终止;如在加2 ,3 -ddGT P的反应中,凡需

10、要dGT P时,链延伸即在此终止。经凝胶电泳,即可从放射自显影或荧光检测(自动测序仪上读出4组反应产物的D N A序列。2 2 需要注意的问题2 2 1 引物的选择 一般选择待测物种已知DN A序列中长2030个碱基的保守片段。如果待测物种的D NA序列为未知时,选择近源或同源物种的已知D NA 序列的某一片段为模式合成引物,以已知的该物种的组织细胞作为阳性对照与药材同时提取DN A,相同条件下扩增和测序,将所测序列与阳性对照的序列进行比较。2 2 2 P CR反应中温度的选择 一般情况下,变性和延伸温度在95 和72 ,退火温度(与反应产物的质量有直接关系则因物种和模板而异,需要摸索比较,一

11、般在40 60 之间。2 23 避免污染 在药材DN A提取和扩增的同时均应设立空白和阴性对照。2 3 应用现有的研究多集中在对动物药材的鉴定。例如:鸡内金与鸭内金9;鹿鞭与牛鞭、驴鞭;鹿茸等。2 4 该方法的特点优点:可以利用前人所测物种的D N A序列,建立 对照序列 文库,不必每次都用对照品,技术稳定,重现性好,结果准确清楚。特别是动物药材的伪品许多是用同科同属或家养动物的相应组织器官伪充,而多数家养动物的DN A序列已有报导,可建立这些相关动物的对照序列文库。可从这些D N A序列中查出是何种家养动物的组织器官伪充,结果明确。每测一个物种的D N A序列,均可输入原有的对照序列文库中,

12、供他人和自己以后之用。缺点:对受试基因组有特定要求(必须了解受试基因组或同源或近源物种DN A的序列,以便设计或选择适当引物操作相对复杂,成本高。也由于此,普及和推广较困难。3 随机扩增多态DNA鉴定药材随机扩增多态DN A(RA P D技术是由W illiam s 等12和Welsh1314等两个小组同时发展起来的,其目的是寻找基因组DN A多态片段作为分子标记。W illiam s称之为R AP D,W elsh称它为A P-PCR(Ar b-i tr ary Pr imer-PCR。3 1 RA PD原理R AP D技术建立在P CR技术基础上,它是利用一系列不同的碱基序列随机排列的寡核

13、苷酸短单链(通常为十聚体为引物,对所研究基因组DN A进行P CR 扩增。RA P D所用的一系列引物的D N A序列各不相同,但对于任一特定引物,它同基因组DN A序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增的反应条件,即在一定范围内模板DN A上有与引物互补的反相重复序列时,就可扩增出此范围内的DN A片段。不同物种基因组D N A中的这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同,就可导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使P CR产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对P CR产物的检测(扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,紫外光灯下检视,拍照。和

14、比较,即可识别这些物种基因组DN A的多态片段。W illiams等已用试验证明这种短的随机引物可以用于扩增从低等到高等各种生物的基因组DN A,并已证明这种多态性是按照孟德尔方式遗传的,因而可以此作为遗传标记,研究物种间的亲缘关系。758Ch in Ph ar m J,1998Decem ber,Vol.33N o.12中国药学杂志1998年12月第33卷第12期3 2 需要注意的问题3 2 1 避免污染:在药材D N A提取和扩增的同时均应设立空白和阴性对照。3 2 2 稳定条件 对同一批样品而言,应尽量使用同一厂家的RA P D试剂,同一台扩增仪,相同的扩增条件,避免条件改变引起带型变化

15、。3 2 3 结果判定 对于未知药材而言,由于RA PD所用引物较短,需要用几个到几十个引物,才能看出种、属、科间的差异(多态性,在显示这些差异的同时,也显示出种内或产地的多态性15,这就必须通过计算来排出个体差异,而不能仅依据电泳带的数量和大小作结论。3 3 药材RA P D图谱数据处理目前对R AP D数据处理还没有建立起一套较完整的统计体系。目前多采用同工酶或RF L P(restrict ion fr ag ment leng th poly mor phism数据的统计方法。较常用的有2种: 计算基因相似系数(genot ypess-similary又称共享度,以N ei公式计算。公

16、式:F= 2N x y/(N x+N y公式的定义是:N x y为X和Y扩增的共享片段数,N x和N y为X和Y扩增的总带数。通过研究王义权15认为:亲缘关系越近,共有片段越多,共有片段的多少可以用于确定种、属间亲缘关系的远近;共享度越大,亲缘关系越近,共享度从一个方面反映了物种间亲缘关系的远程度。 利用DN A S IM DEX程序计算,求得其相似度指数(Similat ity I ndex es10。3 4 RA PD方法鉴定药材的特点优点:RA P D法只需微量DN A,并且对受试基因组无特定要求(不须知道受试基因的DN A的背景材料,检测灵敏度高,操作简便快捷,成本低。缺点:扩增条件的

17、变化会影响RA P D的结果,故每一次试验都必须设立阳性对照(对照品;需要筛选许多引物,选择不具种内和产地多态而具种间或属间多态的引物,建立遗传标记,结论需经计算方能得出,而不是直接得出;带型判断具一定的主观性,需具一定的经验。当样品掺伪时,不能得出准确结果。3 5 应用现有的研究多集中在植物药材方面,例如:人参、西洋参、三七1617;苦地胆、甘草、蒲公英、淫羊藿10、木蓝4等。分子生物学技术鉴定药材是继70年代发展起来的以色谱法、光谱法、X射线衍射法、电泳法等测定药材遗传基因表达产物之后,新发展起来的一种直接测定药材遗传物质DN A的具有准确可靠特点的新方法,它将成为今后药材真伪鉴定技术的研

18、究方向。动物药材由于入药部位特殊(许多是动物的局部组织和器官入药,外型的可塑性大,常规的形态分类方法难以作出准确结论,所以此技术在动物药材真伪鉴定方面具有广阔的发展前景。但也具有一定的局限,目前尚不能鉴定掺伪药粉也不能用于中成药的鉴定。参考文献4张荣,张步振,叶浩.用RAPD分析法鉴定木蓝属生药.中国中药杂志,1997,22(2:72.5Higu chi RG,Bow nm an B,Freib erger M,et al.DNA S equences from th e quagga,an extin ct of th e h ors e fam-ily.N atur e,1984,312:

19、284.6Hin guch i RG,Wr isdhin k LA,Oakes E,et al.M ito-chondrial DNA of the ex tinct quagga:relatedn ess and sx-ten t of postmortem of ch ange.J M ol,1987,25:283.7Paabo S,Giford J A,W ilson AC.M itochondrial DNA s e-quences from a7000-year old brain.N uc Ac id R es,1988,16:7775.8S aik i RK,Gelfand DH

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