新型高效破乳剂在青霉素生产中的应用

1、新型高效破乳剂在青霉素生产中的应用III,l研腼号%咯蒜咯略电弋刊细的阐述.新型高效破乳剂D925m采用了混合的外表活性剂体系,可调性好,适应性强已受到国内主要青霉素生产厂家的关洼.关键词孽里堡机理应用钏,一,青霉素生产工艺中破乳剂的研究开展现状自1929年弗莱明发现青霉素以来,由于其卓着的疗效,在临床上已享盛誉近半个世纪:这期问青霉素生产工艺已有了很大的开展,生产本钱不断下降,产量大幅度增加.现全世界青霉素年产量已超过2万吨,的提取设备也从叠片式别离机(DiskStackCentrifu-gatSeparator),开展到滚筒式离心萃取机(PodbielniakCentrifugalExtr

2、actor),倾析器(ScrollExtractionDe.丁基酮等.萃取操作条件为pH1822,有机相与水破!s专!2/1.由于发酵液中含有大量蛋白质,有机色素及其它生物副产物,所以在萃取过程中产生严重乳化,如果不使用适宜的破乳剂即使用不同韵离心机也不能使两相获得良好的别离,因此,破乳是青霉素生产中的关键技术.国外几十年来的研究主要是提高破乳剂的破乳效题.这些方面虽已获得不少成就,但是由于工业技术保密因而从公开发表的文献中很少能获得这方面的信国Petroite公司生产的DEMULSO系列,英国及荷兰AKZo公司生产的D5387系列以及意大利生产的D毗啶(PPB)及十二烷基三甲基漠化铵(123

3、1),各种破乳剂的性能对照列于表1.裹1各类破乳剂的比照美国的DEMLsO一3的破乳效果最好,其次是英国的D5387m,美国的DEMuLs01的浓度(质量车项日得到国家自然科学基金的资助华北制药厂车刊编委,中国科学院院士×要求严格.1231浓度低时产生乳化作用,所以尽管3化工时刊;化工纵横;PPB较1231贵,又有吡啶环所产生的环境污染,国内几十年来主要使用PPB作为青霉素提取工艺的破乳剂,由于PPB使用浓度较高,仅华北制药厂102车间一年就消耗PPB100多吨,价值近200万元.二,破乳机理探讨(一)蛋白质的根本性质青霉素发酵滤液中含有大量的蛋白质,是产生乳化的主要原因.所以,我们

4、首先应对蛋白质的根本性质有一初步了解.蛋白质主要是由氨基酸组成的组成蛋白质根本结构的二十种氨基酸,除脯氨酸外,均有一通式(RCHNH,COOH),其中R一代表侧链基团,不同的氨基基酸分子中同时拥有氨基和羧基,所以,酸碱性质也是蛋白质的根本性质之一.蛋白质分子上的正负电荷相等时(净电荷为零)称淀.然而处于等电pH的蛋白质,其分子上的正负电荷并不是完全由蛋白质本身的正电基团和负电基团所奉献.蛋白质不仅同H结合,而且也和溶液中的其它离子结合这样,由于结合缓冲液中的阴离子多于阳离子,就增加了蛋白质的负电荷,直接影响了等电DH值.结合的阴离子越多,等电pH愈向低值移动.及其浓度.pH在等电点以上,蛋白质

5、带负电,在等电点以下,那么带正电阳离子外表活性剂由于静电相互作用通常能束缚在阴离子化台物上,从而中和掉它们所带的大局部电荷,因此能和蛋白质形成复合物沉淀出来.,影响蛋白质变性的因素可分为两类:一类是化学因素.它包括酸,碱;有机溶剂,重金属盐类,脲,胍,表面活性剂等等.另一类是物理因素它包括热,紫外性形式如下:l物理性质的改变:旋光值改变,特性粘度增加.紫外和红外吸收谱变化,出现流动双折射,失去结晶能力,溶解度下降,有的甚至凝集,沉淀.2化学性质的改变:1)蛋白质在变性前,不易教蛋白水解酶术解,但变性后,术解速度就加快了,水解的部位亦大大增加;2)在变性之前,埋藏在蛋白质分子内部的某些基团,不能

6、与某些试剂反响.但变性之后,41996年(10卷)第4期应了:3生物性能改变:抗原性改变;生物功能丧失.生产车间的滤液般pH67,透明,粘度小,对于青霉素发酵滤液溶剂萃取过程.由于搅拌,加酸,油水混合等外界条件的改变及影响,系统变粘稠,成乳状液,其影响蛋白质变性的主要条件有:oH的影响大多数蛋白质,仅在pH410内是稳定的,超过此范围,就发生变性.在pH低于等电点时,产生净的作用的太小,依赖于介质的介电常数,溶剂和配对离子氛的屏蔽程度.蛋白质对酸,碱的稳定性,主要取决于其分子外表的电荷分布.在许多情况下,酸,碱变性是与埋藏在蛋白质分子内部的基团的不稳定性有关:当pH超过该基团的pK值的几个单位

7、时,此基团就转移到蛋白质的分子外表上.有机溶剂的影响一般认为,有机溶剂可以影响静电力,氢键和疏水的介电常数,因此,当向蛋白质溶液中参加有机溶剂时,那么使介电常数降低,因而增强了蛋白质分子问的静电作用力,减弱了蛋白质和溶剂分子同的相互作用,导致蛋白质发生聚集而沉淀.盐的影响由大量的实验总结出一条根本规律是某些离子(如硫酸根离子)能够提高蛋白质构象的稳定性,同时,也能使蛋白质的溶解度下降,换句话说,就是能够盐析蛋白质;而某些离子(如钙离子,硫氰酸根离子等)能够降低蛋白质构象的稳定性(使蛋白质变性),同时也能提高蛋白质的溶解度,即有盐溶作用.关于离子与蛋白质相互作用的机制.有两种考虑:一种是离子对蛋

8、白质分子内部的极性基团的直接作用:另一种是离子改变溶剂的结构,以影响水分子与蛋白质极性侧链基团的相互作用,从而间接地影响了蛋白质构象的稳定性.外表活性荆的影响外表活性剂是一大类具有两亲性(亲油,亲水)的物质.它们有两个独特的性质+其一是易于吸附于物质的界面(包括气一液,液一液,圃一液界面),从而大大地改变物质界面性质和物质间相互作用的界面过1996年(10誊)第4期;化工纵横,一程:其:是在水溶液罩聚集而形成胶团,在水相中提供类似r液烃的微环境一+般认为外表活性剂很容易与蛋白质反成,常常弓l起蛋白质的亚基或单个肽链的变性这类物质的特是,在很低的浓度下,就能和蛋白质高度作用.趴而极太地改变蛋白质

9、分子的构象.(二)乳状液的形成及破乳机理两种不互溶的纯液体之问的界面张力总是大于度-荇.这种乳状液非常不稳定,正困为如此,阿种纯液体不能形成乳状液乳化剂的功能是稳定此种乳状液它们通常通过吸附于界面膜来起作用这种定向数;2通过形成机,空间和或电方面的l旰障以阻止分散柑的策结在吸附有表ll性剂的界面区,界面两侧的张力可以不同.在表;性剂分的亲水端和水分子之问的界而张力可以不同于外表活性剂分子的亲油端和油州分子之问的界面张力.形成乳状液时,界面区将弯曲以缩小界而张力较大一侧的面积,使界面吉布斯函数减少如果亲油端的界面张力大于亲水端,那么(yw乳状液.另方面,如果亲水端的界面张力大干亲油端,同理.那么

10、形成W,o乳状液一易溶于油的乳化制当然在界面油侧产生较低的界面张力,生成w/O乳状液而易溶于水的乳化刺那么生成(yw乳状液.这即为13ancroft规那么.乳状液是一种多相分散体系,它是种液体以极小的液滴形式分散在另一种与其不帽混溶的液体中所构成的:它们是热力学不稳定的多分散体系,有一定的动力学稳定性.程中蛋白质萼发生变性这些变性蛋白质本身又具有表活性.故按Bancroft规那么,形成T,O乳状液:pH此乳液自三种途径:i预先除去这些要变性的蛋白质:21人一种物质能和蛋白质作用形成沉淀物;3引入一种亲水性外表活性剂,此外表活性剂的乳化能力要止其变性,对于阳离子表而活性剂(如PPB.1231),

11、当将其加分相快.不乳化只有酸化滤液晤,由于蛋白质的变性才产生w/o乳状液,这也证明乳化是由变性蛋白质引起的一由于阳离子外表活性剂带正电,溶液中蛋白化工时刊入最少时【质量分数<10x10I4).由于变性蛋白质的增多.W/0乳化加强,可观察到有机相即使在离心重.当PPB或1231加人量增加后,这时除和蛋白质作用外辽有局部阳离子外表活性剂存在,易溶于水的液.随着阳离子外表活性剂浓度进一步提高,那么W/0的复合物由于其相对分子质量大.沉于水底,界面无固体一我们的实验还说明.破轧剂浓度一定时,pH愈低,由于变性蛋白质的增多.破乳效果愈差.综上所述,在较高浓度F(一般质量分数500×

12、;10),阳离子外表活性剂的破乳效果优良但由作用并带一些色素于溶媒(PPB试剂中的色素1一因其结合牢固,一般反萃.脱色不能使溶媒再生【需蒸馏)且使反萃段易乳化此外,由于其本身破乳机理的要求,需要破乳剂浓度较高,这也增加了生产本钱:PPB的毒性还存在环境污染问题:故现用阳离子破乳剂是有很大缺点的.阴离子外表活性剂,如(亚)油酸钠,十二烷基苯磺酸钠,石油磺酸钠,十二烷基硫酸钠(SDS)等,其破乳机理和性能不同于阳离子外表活性剂.(亚)油酸钠由于其既不能和蛋白质形成复合物,而且形成w乳液的能力叉较弱【HLB=I8),故破乳效果较差.HLB,即亲水亲油平衡(HydrophileandLipophile

13、Balance),HLB值越大说明外表活性剂(有时称为"两亲性分子)的亲水性就越强,即外表活性剂形成()/W乳液的趋势愈强.SDS有较高的HLB(HLB=40),故形成W乳液的能力较强,同时,在较低的浓度下,就能和蛋白质高度结台,破坏蛋白质中几乎所有非共价的相互作用:各种蛋白质与SDS结合的比例很相似而且SDS蛋白质复合物(每克蛋白质束缚14克SDS)的物理研究提出了一个SDS一蛋白质复合物模型:这个模型是一个直径恒定.长度相当于肽链长度的细棒.其大小相当于沿螺旋长度插入SDS分子的类螺旋构象.进一步实验说明,溶液中pH改变使蛋白质分子中有序的螺旋结构变为无序结构=其结构变碍梧散而易

14、翻开.暴露出疏水基团,SDS的脂肪族侧链可能与蛋白质外露区域的非极性基团相互作用,而留在蛋白'化工时刊一一一;化工纵横;'.1_l一一外面的基团被SDS分子所掩盖.目为SI)S的阴离子与蛋白质的主链结合.其比例大约是一个SI)8与两个氡摹酸残基结台.这就使得)S与变性的蛋白质形成一十净负电荷很多的复合物,其电茼大体上与蛋白质的质成正比,所复合物外表的大负电荷,阻止了复台物之间的聚集,太大增加了复台物的溶解性能,导致了乳化能力的下降=由SI)S破乳的机理可看出,低浓度的)s即叮有较好的破乳效果一实验结果也证实这.SI)S的缺点是.在?定的条件下,它要影响青霉素的萃取一非离子外表活

15、性剂琉水基原料是具有活泼氧原子的疏水化合物,如高碳脂肪醇,脂肪酸,高碳脂肪胺,脂脐酰胺等物质非离子表丽活性剂,在水中不会解离溶性一水溶性大小与聚氧乙烯醚基的多少有很大关系.般兑来,n数约为510能使化台物有良好水溶性:.困其具有优异的外表性能及易于生物降解,故近年来在国内外开展甚决.从目前开展莳势来看,非肪醇聚氧乙烯醚用作纺织助荆硬聚醚类石油破乳我们经过大范围的筛选和破乳规律的探讨,发现有部说明,影响蛋白质乳浊液稳定的因素是多方面的,又是相界面问的吸附性质.非离子表而活性荆分子的亲水基在界面展开,使得蛋白质外表吸附膜局部变薄.于是膜破裂,到达破乳的Et的,因此破乳的原因一方面是破乳剂分子取代了

16、溶液中蛋白质分子中的局部肽链,形成了强度较差的膜;同时,由于库伦引力的作用,必有一局部电荷相反的小离子(称之为反离子,如钠离子等)结合在蛋白质非离子外表活性剂的加使反离子结合度下降,减少_r外表层的局部离子,降低了乳状液的稳定性,使之易性剂分散在水相的情形.如当加少量非离子外表活性剂时.可能形成溶剂化膜,结果分散性加强,阻止了蛋白的变性.当加人量足够高时,那么按前述方式进行,而不是形成复合沉淀物,所以只产生少量蛋白变性的产物实验结果证实_破乳后产生的沉淀物介于油水界面61996年(10卷)第4期由于青霉素发酵滤液的组成十分复杂,应受多种使用非离子外表活性剂进行破乳存在适应性不强的问题.而且单一

17、体系的破乳剂也达不到最正确破乳效果,因此破乳剂的筛选工作主要将集中在混合体系.(三)新型高效破乳剂的选择在生产实践中应用的外表活性剂一般皆为混合贵,更主要的是因为混台外表活性剂的使用效果往往度,对外表活性剂混合体系进行了初步的筛选首先对同电性的混合体系(包括阳离子一阳离子体系,阴离子一阴离子体系和非离子一非离子体系)进行对照比较.发现三种俸系的最正确破乳效果相当.此后对离子一非离子体系c内分阴离子一非离子体系和阳离子一非离子体系)进行了破乳效果的实验,发现无论是阴离子还是阳离子与非离子外表活性剂的混合物的破乳效时作用效果更明显:在此根底上首次提出了助破乳剂的概念,对混合体系外表活性刑的作用机理

18、进行较系统的研究,提出破乳剂的主要成份应有:破乳剂,西同破乳剂(助破乳剂),分散剂和润湿剂,明确_四个组份之间的作用及相互协调性.经过反复研究改良,终于获得扩试成功,1993年6月通过中科院和国家医药总局到国际先进水平,局部指标超过国际先进的同类产品.D925m的特点是由于选择了外表活性剂的混台体系,所"其破乳效果显着且适应性强;同时可根据所验,可得以下几点结论:L,DO25m的加人量低时(质量分数×10.),主要起稳定蛋白质构象和分散作用,表现出非强,表现出阳离子外表活性剂的特性.2,D925m的参加对青霉素的革取率根本上没有乳化,分相快污染程度比PPB明显下降,水份也低

19、.对产品质量没有影响.3,D925m的水溶性强,萃取平衡pH趣低,D925m水溶性愈强,虽然这时蛋白质的变性也越严重,但是总剂为主,所以易降解,减少"三踱"污染.1996年(10卷)第4期;化工纵横一一4,D925m使用前无需预处理,在室温或略高于室2t%.放置20个小时后仍无分相现象:2-,新型高效破乳剂的推广应用生产的状况,提出破乳渣相均衡分配原那么,改良了13925m生产工艺和流程,完善_rD925m破乳剂系列用,受到广阔用户的一致好评一新型高效破乳剂D925m采用混合的表而活性的应用前景:开始就受到青霉素生产厂家的关注,希望能将研究成果迅速有效地在工业规模生产中得到

20、应用一据统计目前国内青霉素提取工艺中广范使用的分离设备主要以TA叠片式离心机为主,其次是S(;550套筒式离心机,以及新引进的Pod机和Decantor机等,前三者适用于发酵滤液的提取,后者适用于全发酵号的离心别离设备,也曾使用过国内外多种破乳剂:从1993年3月起,D925m在华北制药厂102车间已连续在工业规模生产上得到应用,它以TA机为主,兼机为主,兼有1)ecantor机,与新近使用的进口英国破乳剂D5387相比,节省用量近50%,即D5387用量的破乳剂1231【十二烷基三甲基演化铰)相比节省用量102车间一年消耗PPB一百多吨.价值二百多万元,改用新破乳剂D925m,那么可降低本钱达百万元,如推广全国.每年将创近千万元的经济效益,同时也可节约大量外汇由于新型高教破乳剂D925m具有无毒,无污染等用过I)925m的抗生素生产厂家均反映是目前国内外破乳剂中破乳效果最好.适用性最强的高效破乳剂(有些还起名叫破乳灵).现已在江西东风制药厂,山东济宁抗生素厂,唐山冀东制药厂(现华北药厂唐山分公化工时刊司)及河北制药厂等国内主要青霉素生产的厂家推广使用四,结论l青霉素提取工艺中的新型高效破乳剂的研究不但有理沦意义,如蛋白质与外表活性剂,有机溶剂之问的作用规律的研究等,而且也诅有经济价值:2这一