第四章 蛋白质化学 第六节蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定

1、1一、一般原则及基本步骤一、一般原则及基本步骤 第六节第六节 蛋白质的分离纯化与测定蛋白质的分离纯化与测定2二、蛋白质的分离纯化方法二、蛋白质的分离纯化方法（一）根据（一）根据分子大小分子大小不同的纯化方法不同的纯化方法 （二）利用（二）利用溶解度溶解度差别的纯化方法差别的纯化方法 （三）根据（三）根据电荷电荷不同的纯化方法不同的纯化方法 （四）利用（四）利用选择性吸附选择性吸附的纯化方法的纯化方法 （五）利用（五）利用配体配体的特异性亲和力的纯化方法的特异性亲和力的纯化方法 3（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1.1.透析和超滤透析和超滤 2. 2.密度梯度离

2、心密度梯度离心 3. 3.凝胶过滤凝胶过滤1.1.透析和超滤透析和超滤半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维材料其他改型纤维材料超过滤（超过滤（ultrafiltration） 利用压力、抽滤（

3、利用压力、抽滤（A）或离）或离心力（心力（B）等多种形式，强行使）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用在膜表面上堆积，现常用截向截向流过滤流过滤的方法，即液体在泵驱的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分动，在膜上形成压力，使部分液

4、体透过膜，而另一部分液体液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。蛋白质分子冲走。滤膜滤膜抽气抽气滤膜滤膜离心离心AB2.密度梯度离心法（密度梯度离心法（density gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前

5、，介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯化铯等。化铯等。滴加样品滴加样品离离心心管管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度73.3.凝胶过滤凝胶过滤 原理：原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是筛层析。它是60 60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。

6、由于被小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小分离物质的分子大小（直径）和形状不同（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。 应用应用 测定分子量测定分子

7、量8分子筛层析原理示意图分子筛层析原理示意图分分子子筛筛层层析析与与洗洗脱脱曲曲线线凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)G-200G-100logMrKav11（二）利用溶解度差别的（二）利

8、用溶解度差别的纯化方法纯化方法 1.1.等电沉淀和等电沉淀和PHPH控制控制 2. 2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 3. 3.有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离 4. 4.温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响1213防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障蛋白质周围的水化层（蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)，使蛋白质形成稳定使蛋白质形成稳定的胶体溶液。的胶体溶液。蛋白质蛋白质分子间静电排斥作用。分子间静电排斥作用。（存在（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原

9、因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。层。141.1.等电沉淀和等电沉淀和PHPH控制控制 蛋白质处于等电点，其他条件相同时，它的溶解度达蛋白质处于等电点，其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。到最低点。 在等电点以上或以下的在等电点以上或以下的pHpH时，蛋白质分子携带同种符时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。因此溶解度较大。 不同的蛋白质具有不同的等电点

10、不同的蛋白质具有不同的等电点15 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：现以下两种情况：（1 1）“盐溶盐溶”现象现象(salt-in)(salt-in)低盐低盐浓度浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大质溶解度增大 。（2 2）“盐析盐析”现象现象(salt-out)(salt-out)高盐高盐浓度浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降解度随之下降 。2.2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析163.3.有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离（1 1）有机溶剂

11、可以使蛋白质沉淀）有机溶剂可以使蛋白质沉淀 主要有乙醇、主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。丙酮、乙酸乙酯等。（2 2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。电区。（3 3）有分级分离现象）有分级分离现象（4 4）要求对有机溶剂低温预冷。）要求对有机溶剂低温预冷。174.4.温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约在一定温度范围内，约0-400-40之间之间，大部分球状，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从例如人的血红蛋白从0 0到到2525，溶解度

12、随温度上升，溶解度随温度上升而降低。而降低。 在在40-5040-50以上开始以上开始变性变性，一般在中性，一般在中性pHpH介质中即介质中即失去溶解力。失去溶解力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在分级分离操作一般都在0 0 或更低的温度或更低的温度下进行。下进行。18（三）根据电荷不同的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法 1.1.电泳电泳 2. 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 3. 3.毛细管电泳毛细管电泳 4. 4.等电聚焦等电聚焦 5. 5.层析聚焦层析聚焦 6. 6.离子交换层析离子交换层析191.1

13、.电泳电泳 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别电场中的迁移的差别达到分离达到分离目的的。目的的。 蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（凝胶电泳（gel electrophoresisgel electrophoresis）。）。 一般凝胶介质中的一般凝胶介质中的pHpH被维持在被维持在碱性区碱性区，目的是使大多数蛋白质，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向

14、阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。白质的质量和带电荷的多少有关。电电泳泳技技术术分分类类垂直板电泳垂直板电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳212.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresis,electrophoresis,简称简称PAGEPAGE) )， 它以聚丙烯它以聚丙烯IftIft胺凝胶为支持物，一般

15、制成凝胶柱胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是分是浓缩胶浓缩胶，大的部分是，大的部分是分离胶分离胶） 这样这样, ,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的而成很薄的起始区带起始区带（厚度约为（厚度约为0.1 mm0.1 mm），然后），然后再进行电泳分离。再进行电泳分离。223.3.毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（管（ 2-75m2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，）中装入缓冲液，从其

16、一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。实现了快速和高效分离。 4.4.等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusingisoelectric focusing）在一定抗对流介质（如凝胶）在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体，当直中加入两性电解质载体，当直流电通过时，便形成一个由阳流电通过时，便形成一个由阳

17、极到阴极极到阴极pHpH值逐步上升的梯度值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其，就被浓集在与其pIpI相等的相等的pHpH区域，从而使不同化合物能按区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。其各自等电点得到分离。pH10pH3pI1= pH8pI2= pH7pI3= pH5-+线线性性梯梯度度5.5.聚焦层析（聚焦层析（ChromatofocusingChromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白

18、质按其等电点在是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、

19、解吸附，直到在等电点pH时被时被洗出。在聚焦层析过程中洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且并且有一定的时间进行聚焦有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图25 离子交换法是离子交换法是通过带电的溶通过带电的溶质分子与离子质分子与离子交换剂中可交交换剂中可交换的离子进行换的离子进行交换而

20、达到分交换而达到分离纯化的方法。离纯化的方法。6 6 离子交换层析原理离子交换层析原理26开始开始吸附吸附解吸解吸解吸结束解吸结束再生再生样样品品解解吸吸剂剂再再生生剂剂-+-常用的阳离子交换剂常用的阳离子交换剂离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型） 羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型） 磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺丙基磺丙基常用的阴离子交换剂常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 氨基乙基氨基乙基离

21、子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -纤维素（强减型）纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基） -氨基乙基氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）29（四）利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析 某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其某些称为吸附剂的固

22、体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而定。物质的性质而定。吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引力力。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。301.羟磷灰石层析 吸附剂羟磷灰石即结晶磷酸钙，它用于分离吸附剂羟磷灰石即结晶磷酸钙，它用于分离蛋白质或核酸。蛋白质或核酸。 据推测，蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶据推测，蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸体表面的钙离子结合，而带正电

23、基团与磷酸基相互作用。基相互作用。 羟磷灰石层析最重要的用途之一是把单链羟磷灰石层析最重要的用途之一是把单链DNADNA和双链和双链DNADNA分开。分开。312.疏水作用层析 疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。别发展起来的一种纯化技术。 连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。市售的疏蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。市售的疏水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。 为使吸附达到最大，可将蛋白质样品的为使吸附达到最大，可

24、将蛋白质样品的pHpH调至调至等电点附近。等电点附近。32（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法 亲和层析是利用亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子蛋白质分子对其配体分子特有的识特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。的纯化方法。 亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。当高。 亲和层析最先用于亲和层析最先用于酶的纯化酶的纯化并从中得到发展，并从中得到发展，亲和层析（亲和层析（affiu

25、ity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、 抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a. 理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex