微生物快速检测方法及应用进展

1、微生物快速检测方法及应用进展<    【关键词】  微生物快速检测随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至 医院 内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与1

2、，2。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。    1  即用型纸片法    3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数3。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品4，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简

3、便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果5。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短35 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶底物反应法。只需检测食品中大肠菌

4、群、大肠杆菌的有关酶的活性，将荧光产物在365 nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理，4保存，简化了实验准备、操作和判断6。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。    2  生物化学技术    2.1  PCR技术  PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微

5、生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有 经济 效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。    2.2  基因探针技术  基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNARNA或DNADNA链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基因探针的优点是减少了基因片段长度

6、多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的GENPROBE基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验7，基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。    3  选择、鉴定用培养基法    在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，可使目标培养物的选择、分离、鉴定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血浆+纤维蛋白原)培养基，可在24 h内鉴定金黄色葡萄球菌8。Merk公司的chromocult Coliform Agar培养基上，大肠杆菌为墨绿色至

7、紫色菌落，沙门菌为淡绿色至蓝绿色菌落。柠檬酸杆菌和克雷伯杆菌为橙红色至红色菌落，其他肠道菌为无色菌落9。这个方法对操作者要求不高，短期培训合格后即可上岗，从而取得一定的经济效益和社会效益，应用前景十分广泛。   4  免疫学技术    免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成10。此技术对操作者要求也不高，是目前为止基层单位应用

8、时间最长最为广泛的一项快速检测技术。如采用免疫磁珠法可有效地收集、浓缩神奈川现象阳性的副溶血性弧菌，可显著提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率11。胶体金免疫层析法能快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌12，应用胶体金免疫层析法检测乙型肝炎表面抗原，可大大提高工作效率13。ATP生物发光法是近年 发展 较快的一种用于食品生产加工设备洁净度检测的快速检测方法。利用ATP生物发光分析技术和体细胞清除技术，测量细菌ATP和体细胞ATP， 细菌ATP的量与细菌数成正比，用ATP生物发光分析技术检测肉类食品细菌污染状况或食品器具的现场卫生学检测，都能够达到快速适时的目标14，15。微型自动荧光酶标分析

9、法(mini VIDAS)是利用酶联荧光免疫分析技术，通过抗原-抗体特异反应，分离出目标菌，由特殊仪器根据荧光的强弱自动判断样品的阳性或阴性。VIDAS法检测冻肉中沙门菌具有很高的灵敏度和特异性，用于进出口冻肉的检测，可大大缩短检验时间，加快通关速度16，检测冻肉中李斯特氏菌亦如此17。    5  细菌直接计数法    主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量鉴定18。目前已经建立了细菌总数19、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌20等的FCM检验方法。固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测21。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采