小鼠急性酒精性肝损伤模型的动态研究

1、·378·中图分类号：R114文献标识码：A文章编号：10023127（2010）05037803·实验研究·小鼠急性酒精性肝损伤模型的动态研究赵敏，黄俊明，谭剑斌，周轶琳，杨杏芬，陈瑞仪，胡帅尔，黄建康（广东省疾病预防控制中心毒理所，广东广州510300）【摘要】目的建立小鼠急性酒精性肝损伤模型并筛选敏感检测指标。方法实验分8个组，实验组小鼠采用一6、8、10、12、16、20和24h，次经口灌胃50%的乙醇（12ml/kg）后禁食4、相应对照组灌胃给予纯净水并禁食同等时间。血液生化指标检测包括血中三酰甘油（TG）、胆固醇（CHOL）、丙氨酸转氨酶（A

2、LT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、GGT）；16h实验组和对照组血中高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白胆红素（TBIL）和Y-谷氨酰转酞酶（Y-（LDL）含量；并取动物肝脏，冰冻切片苏丹染色后，观察肝组织脂肪变性程度。结果组织脂肪变性程度明显加重。结论【关键词】酒精；急性；肝损伤经口一次灌胃给予小鼠50%的HDL值显著降低、乙醇后禁食16h，实验组与对照组比较呈现明显的脂质代谢紊乱，包括血中TG含量显著升高、病理肝50%的乙醇经口灌胃一次后禁食16h，在该实验条件下，可造成小鼠急性酒精性肝HDL含量及肝组织脂肪变性程度等指标进行模型评价。损伤模型，可通过测定血中TG、目

3、前国内外尚未建立完善的急性酒精性肝损伤的动物模型，因此探索酒精性肝损伤的机理，筛选对预防建立一个与人类酒精酒精性肝损伤有效的保健食品，性肝损伤发展病变过程相似的动物模型极为重要。本文对小鼠急性酒精性肝损伤模型的研究，以期建立小鼠急性酒精性肝损伤模型并筛选敏感检测指标。11.1材料与方法血液生化学指标检测：各时间点实验结束，动物均采用戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，进行血中三病理组织学检查：取新鲜小鼠肝脏左叶做冰冻切片，苏丹染色后镜检并评分。镜检主要观察脂滴在肝脏分布的范围和面积。0分表示肝细胞内脂滴散在，稀少；1分表示含脂滴的肝细胞不超过肝脏面积的1/4；2分表示含脂滴的肝细胞不超过肝脏面积的1

4、/2；3分表示含脂滴的肝细胞不超过肝脏面积的3/4；4分表示肝组织几乎被脂滴代替。结果11012周龄、动物昆明种雄性小白鼠，体重30g左右，广东省医学动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2008-0002。颗粒饲料由广东省医学动物中心提供。动物实验室为SPF级，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2008-0011，室温（22±2），湿度60%80%。1.2用体积分数为50%的乙醇（分析纯，以蒸馏水稀释）造成肝损伤模型，灌胃量12ml/kg剂量和分组（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为4.80g/kg）。实验分8个组，每组10只动物，分别为乙醇灌胃后禁6、8、10、12、16、

5、20和24h处死动物；每组均设阴食4、阴性对照组按相同的量灌胃给予洁净水，并与性对照，相应实验组禁食同等时间。1.3观察指标血液生化指标6、8、10、12、16和20h见，给予50%的乙醇后禁食4、时酒精实验组TG含量与对照组比较有上升趋势，其10、12、16和20h，中8、实验组与对照组比较，差异有基金项目：保健食品功能评价方法及有关程序修订项目（2009）作者简介：赵敏，博士，副主任医师，研究方向：食品毒理学与毒性病理学。并列第一作者：黄俊明，主任医师，研究方向：食品毒理学。统计学意义（P<0.05）。给予50%的乙醇后禁食424h，酒精实验组CHOL与对照组比较，差异无统计学意义（

6、P>0.05）。表1给予50%的乙醇后禁食不同时间小鼠血中三酰甘油的变化禁食时间（h）0.74±0.280.78±0.19注：与对照组比较，对血中ALT和AST含量的影响：由表2可见，给予50%的乙醇后禁食4h，酒精实验组ALT和AST与对照组比较上升，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各实验组和对照组比较未见显著性差异。表2给予50%的乙醇后禁食不同时间小鼠血中ALT和AST的变化禁食时间ALTAST16.7±6.316.7±3.255.8±9.557.0±16.6注：与对照组比较，*对血中AKP含量的影响：由表3可

7、见，给予50%的乙醇后禁食4和6h，酒精实验组AKP与对照组比较上升，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各实验组和对照组比较，未见显著性差异。表3给予50%的乙醇后禁食不同时间小鼠血中AKP的变化禁食时间（h）107.2±17.488.4±35.0注：与对照组比较，*对血中TBIL和Y-GGT含量的影响：给予50%的乙醇后禁食424h，酒精实验组TBIL和Y-GGT与对照组比较，差异无统计学意义。表4给予50%的乙醇后禁食16h对小鼠血中HDL和LDL的影响组别剂量（g/kg）4.801.40±0.49*0.19±0.06注：与对照组比较，*P

8、<0.05；n=10。2.2肝脏病理组织学变化实验组动物肝脏的病理改变以肝细胞脂肪变性为主（图1）。对照组肝细胞内也可见脂肪变性，伴随禁食时间不同，脂肪变性程度不同。冰冻切片，苏丹染色；ZEISSAxioskop40，×10图1经口灌胃50%乙醇后禁食16h实验组和对照组肝细胞脂肪变性比较由图2可见，给予50%的乙醇后禁食4、6、10、12、16和20h，酒精实验组肝脏脂肪变性病理评分值与对照组比较升高，其中16和20h实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。3讨论目前，酒精的消费量呈全球性猛增，同时酒精性肝病（alcoholicliverdisease，A

9、LD）的发病亦见显著增加。本文建立小鼠急性酒精性肝损伤模型目的是为了快速准确地筛选对酒精性肝损伤有辅助保护作用的保健食品。急性酒精性肝损伤的机制为机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，乙醇可致-磷酸甘油增多而促进TG合成，致使脂肪在肝细胞内沉积2-3。因此脂质代谢异常为急性酒精性肝损伤的图2给予50%的乙醇后禁食不同时间肝脏脂肪变性病理评分值的变化主要表现。目前国内外关于急性酒精性肝损伤模型的造模方法有两种：一是用56度白酒灌胃，每次7ml/kg，每日2次，共110d；二是腹腔注射一定浓度的乙醇，每次20ml/kg，每日2次，共11

10、0d。结果发现制作大鼠急性酒精性肝损伤模型，灌胃法优于腹腔注射，因为后者死亡率高，且不符合人类饮酒习惯4-6。在以往本课题组对急性酒精性肝损伤模型的研究中发现，禁食和一次大剂量的乙醇冲击，可形成小鼠急性酒精性肝损伤模型，其机制除与乙醇早期可影响肝脏脂质代谢外，可能与禁食也有关，因为禁食可引起肝脏的脂肪动员7。本次研究是在以往研究的基础上，进行酒精的时间-反应关系研究。本文采用小鼠经口一次灌胃给予50%的乙醇并禁食424h，围绕脂质代谢相关指标，检测血中TG、CHOL、HDL和LDL含量及肝细胞脂肪变性程度，选择急性酒精性肝损伤最佳造模时间并筛选敏感指标。结果显示，给予乙醇后禁食420h，实验组

11、动物血中TG含量均呈现增高的趋势，其中禁食820h，实验组与对照组比较差异有显著性意义（P<0.05）；然而血中CHOL含量变化不明显，不同禁食时间乙醇实验组和对照组比较未见显著性差异。可见血中TG指标较CHOL敏感，一次大剂量的乙醇冲击可快速引起血中TG含量的显著升高。以此为基础，研究进行了大量重复实验，血中的TG值均获得较好的一致性。因此考虑将血中TG含量作为急性酒精性肝损伤模型的检测指标。本研究结果亦显示，实验组动物在血脂增高的同时，伴随肝细胞脂肪变性程度的加重。实验组肝细胞脂肪变性程度总体较对照组有升高的趋势，其中16和20h实验组与对照组比较升高明显（P<0.05）。由此

12、可见，肝细胞脂肪变性程度与血中TG含量变化基本保持一致。因此急性酒精性肝损伤模型中，肝组织脂肪变性程度应成为检测的指标之一。在此基础上，将与脂质代谢关系密切的指标血中HDL和LDL纳入检测范围，结果显示给予50%的乙醇后禁食16h，实验组血中HDL值与对照组比较显著降低；但LDL未见显著变化，可能还需增加样本量进行多次验证，以明确LDL指标的敏感性和稳定性。目前研究结果可见，急性酒精性肝损伤动物模型可采用一次经口灌胃给予小鼠50%的乙醇后禁食16h，通过测定血中TG、HDL含量及病理组织学检查肝组织脂肪变性程度等指标来反映模型是否成立。本研究同时发现，小鼠给予一次大剂量的酒精冲击后，血中与肝脏

13、代谢功能关系密切的酶如ALT、AST和AKP会呈现一过性的升高，如ALT和AST含量在给予乙醇后4h、AKP在给予乙醇后4和6h均出现显著增高（P<0.05）；但随着时间的延长很快恢复正常。说明小鼠肝脏具有很强的自主修复和代偿能力。由此推测，急性酒精性肝损伤是否也可选择一次大剂量酒精冲击后禁食4h造模，选取血中ALT、AST和AKP等早期敏感肝细胞损伤指标作为观察对象，建立急性酒精性肝损伤模型。目前保健食品检验与评价技术规范采用检测肝组织匀浆中的MDA和GSH的含量来反应乙醇代谢与肝细胞氧化还原之间的关系。因此，在本次研究的基础上，我们将考虑继续进行肝组织匀浆中MDA和GSH含量的检测，

14、将规范做进一步的完善。参考文献1中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范（2003年版），2003：14-15.2NanjiAA，FrenchSW.Animalmodelsofalcoholicliverdisease-focusontheintragastricfeedingmodelJ.AlcoholResHealth，2003，27（4）：325-330.3LakshmanMR.SomenovelinsightsintothepathogenesisofalcoholicsteatosisJ.Alcohol，2004，34（1）：45-48.4赵静波，王泰龄，张晶，等.大鼠急性酒精性肝损伤模型分析J.中日友好医院学报，1996，16（1）：17-19.5江正辉，王泰龄.酒精性肝病