功能作用机制及应用-西北大学科学技术处

1、一、项目名称： 几种具有重要生理功能的蛋白的制备、功能、作用机制及应用二、主要完成人情况：排姓职称工作单完成单名名位位高1文教授西北大学西北大学运边2六教授西北大学西北大学交3李讲师西北大学西北大学恒4李讲师西北大学西北大学倩赵5新教授西北大学西北大学锋张6椰未 取西北大学西北大学莉得7刘未 取西北大学西北大学慧得对本项目主要学术和技术创造性贡献DXS 及 DXR 酶研究的总体设计。主要论文1、2、 3、 4、 5、6、7、 8、 9、 10、 11、12、13 的贡献者。主要知识产权1、2、 3 的贡献者。Kringle 5 蛋白和 hSDF- 1蛋白研究的总体设计。主要论文 14、 15、

2、 16、17、 18、19、 20的贡献者。主要知识产权4、 5 的贡献者。主要从事 DXS 和 DXR 酶的制备、功能、催化机理及应用研究。主要论文4、 5、 6、 7、 8、10、11 的贡献者。主要知识产权1、2、3 的贡献者。主要从事 Kringle 5 和 hSDF-1蛋白的表达、纯化及后处理。主要论文14、 15 的贡献者。在仪器分析方面给予了本项目大力支持。Kringle 5 蛋白与配体之间的分子识别与相互作用分析。主要论文 14 的贡献者之一。乙酰乳酸合酶的制备及催化机制分析。主要论文 3 的贡献者之一。三、完成人合作关系说明：项目完成人高文运、边六交、李恒、李倩、张椰莉、刘慧

3、。高文运教授主要负责DXS 及 DXR 酶研究的总体设计。合作者边六交教授系本项目第二完成人，边教授在本项目中负责Kringle 5 蛋白和hSDF-1蛋白研究的总体设计。 合作者李恒博士为第一完成人所指导的青年教师，李恒博士在本项目中完成了多种DXS 和 DXR 酶的制备、酶底物的合成、 酶催化机制的分析等工作。 合作者李倩博士在本项目中完成了 Kringle 5 和 hSDF-1蛋白的表达、纯化及后处理工作。合作者赵新锋教授在仪器分析方面给予了本项目大力支持。 合作者张椰莉系第二完成人边六交教授所指导的在读博士研究生， 该生主要进行了蛋白与配体之间的分子识别与相互作用分析。 合作者刘慧系第

4、一完成人高文运教授所指导的在读硕士研究生， 该生进行了乙酰乳酸合酶的制备及催化机制分析。四、主要完成单位排序及贡献：排序单位名称主要贡献第一完西北大学是所有代表作 SCI论文第一作者单位和知识产权授成单位权专利的申请人。五、项目简介：本研究为基础研究， 属于生物技术领域， 是在国家重大新药创制计划和三项国家自然科学基金等多项项目的资助下完成的。针对恶性肿瘤、心脑血管疾病及耐药性病原菌感染的治疗药物研究是我国 “十一五 ”及“十二五 ”期间 “重大新药创制 ”专项中的重中之重！根据这一指导性原则， 项目组分别选定了具有抑制肿瘤细胞的生长作用的人纤溶酶原的第五个环饼区，即 Kringle 5 ；在

5、缺血性心脑病的细胞治疗方面具有潜在应用前景的人源基质细胞衍生因子1（ hSDF-1）；可用于抗生素筛选的新靶标 1-脱氧 -D- 木酮糖 -5-磷酸合酶（ DXS）、 1-脱氧 -D- 木酮糖 -5-磷酸还原异构化酶（ DXR ）以及乙酰羟酸合酶 （AHAS ）等五个功能蛋白， 并从克隆表达、 发酵培养、分离纯化和冷冻干燥工艺等方面对如何高效地获得这些蛋白进行了深入的研究。在能够稳定地获得这些蛋白的基础上，项目组还深入地探讨了它们在诱变剂诱导下与其分子展开-折叠有关的过程和机理（如 Kringle 5 和hSDF-1）；功能和作用机制（如 DXS、DXR 及AHAS ）以及应用等。以上研究工作

6、的科学价值在于：1. 为将 Kringle 5开发为具有自主知识产权的候选 I类生物新药提供更多保障；2. 为深入探索 hSDF-1蛋白的功能、其与 CXCR4相互作用以及它们在缺血性心脑损伤的治疗方面的应用打下了良好的基础；3. 为以 DXS、DXR 及AHAS 为靶点筛选新抗生素提供了重要的理论依据。围绕上述研究， 项目组获得国家重大新药创制专项、 国家自然科学基金（三项）和多项省部级项目的资助。发表 SCI 论文共计三十五篇，国家发明专利授权五项。此外，项目组的研究成果也获得了国际国内同行的认可。六、主要论文专著目录：序影响年卷页码发表时通讯作第一作国内作SCI 他他引总知识产权对应附刊

7、名作者（ xx 年 xx是否归国论文专著名称因子间者者者引次数次数件编号号卷 xx 页）内所有1Antimicrobi almechanism of theMed.Chem. Xian Hui, Ge Yan, 1.282017年 262017-0高文运惠先惠先，44是2-1-1major active essential oil compoundsRes.Fang-Lin,Tian,卷442-4492- 01闫格，andtheirstructure-activityHengLiand页田方relationshipWen-Yun Gao琳，李恒 ，高文运2Antimicrobialmechan

8、ismofSci. Rep.Xian Hui, Qiao4.262016 年 6卷2016-1高文运惠先惠先，theaflavins:TheytargetYue,Dan-Dan3 8945 页2- 12岳俏，1-deoxy-D-xylulose5-phosphateZhang,Heng Li,张旦reductoisom erase, the key enzyme ofShao-Qin g Yang旦，李the MEPterpenoidbiosynthetic& Wen-Yun Gao恒 ，杨pathway少青 ，高文运3Inhibition ofgreen tea andtheFito

9、tera piaXian Hui, Hui Liu,2.702016 年 1132016-0高文运惠先惠先，catechins against 1-deoxy-D-x yluloseFang-LinTian,卷 80-84 页9- 01刘 慧，5-phosphate reductoisom erase, theFei-FeiLi, Heng田方key enzyme of the MEP terpenoidLi, Wen-Yun Gao琳，李biosynthetic pathway018菲 菲，李恒高文运11是2-1-212是2-1-34Cloning and Characteriz ation

10、 of GSTJ. Biosci.Heng Li,Nan Liu,2.242016 年 1212016-0高文运李恒，李恒，34是2-1-4Fusion Tag Stabilized Large SubunitBioeng.Wen-TingWang,卷 21-26 页2- 01刘楠刘楠，of Escherichia coli Acetohydrox yacidJi-YuWang,王文Synthase IWen-Yun Gao婷， 王继宇，高文运5A specificprocess topurifyNaturalYang, S. Q., Deng,0.882015年2015-0高文运杨 少杨少0

11、0是2-1-52-methyl-D-erythritol-4-phosphateproductJ., Wu, Q. Q., Li,10(2)卷2-01青，邓青，邓enzymaticallyconvertedfromcommunicationH., Gao, W. Y.339-340 页箭箭，吴D-glyceraldehyde-3-phosphateands倩倩，pyruvate李恒，高文运6Mechanisticinsightsinto FEBS J.Li, H.; Tian,3.902013 年 2802013-1 高文运李恒李恒，38是2-1-61-deoxy-D-xylulose5-ph

12、osphateJ.; Sun, W.; Qin,卷1- 01田洁，reductoisomerase, a key enzyme ofW.;Gao,Wen-Yun58965905孙伟，the MEPterpenoid biosynthetic页秦巍，pathway高文运7A chemo-enzymaticcascade fortheTetrahedronShao-Bo Dai, Juan2.192012年 532012-9-高文运戴少戴少11是2-1-7one-potsynthesisofLett.Liao,Jie Tian,卷5波，波， 廖1-deoxy-D-xylulose 5-phosph

13、ateandHeng Li, Wen-Yun48094812廖娟娟， 田1-deoxy-D-xyluloseGao*Ren, Gang页洁， 李Wang恒， 高文运8PreparationofIsotopeHelveticaLi, Heng, Shao-Bo1.072012年2012-5-高文运李恒李恒，02是2-1-8Labeled/UnlabeledKey IntermediatesChimica ActaDai,Wen-Yun95(5)卷in 2-Methyl-D-erythritol4-PhosphateGao*683-715 页Terpenoid Biosynthetic Pathw

14、ay9Determination of Steady-State KineticChineseHu, Y., Wang, XJ.,0.82012年 40Parametersof1-Deoxy-D-xJournalofLi, H ., Gao, WY.卷ylulose-5-phosphateSynthasebyAnalytical1859-1864Pre-columnDerivatizationHighChemistrPerformance LiquidChromatographyUsing 2,4-Dinitro phenylhydrazine10Optimizedenzymaticprepa

15、rationofBioorg. Chem.Zhou,Y. F., Cui,3.232010年 381-deoxy-D-xylulose 5-phosphateZ., Li,H., Tian, J.,卷 120-123Gao, Wenyun*页11AnimprovedpreparationofHelv.Chim. Li,H.,Tian,J.,Wang1.072010 年 93D-glyceraldehyde 3-phosphate and itsActa, H., Yang, S.Q.,卷useinthesynthesisofGao, Wenyun1745-17501-deoxy-D-xylul

16、ose 5-phosphate页1戴少波，高文运2012-1 高文运胡玥胡玥，36是2-1-92-1王雪娇，李恒，高文 运2010-9-高文运周跃飞周跃26是2-1-101飞，崔哲，李恒，田洁，高文运2010-9-高文运李恒李恒，718是2-1-111田 洁，王辉杨少青高文运12Biosynthesi s of the iridoid glucoside,PhytochemistyLi, H., Yang, S.Q.,3.212010年 712010-1 高文运李恒李恒，22是2-1-12lamalbid, in Lamium barbatumWang, H.,Tian, J.,卷1690-1

17、0-1杨少Gao, Wenyun694 页青， 王辉，田洁，高文 运13同位素标记 及未标记的 1-脱氧 -D-有机化学高文运1.012010 年 9 卷2010-1- 高文运高文运高文运01是2-1-13木 酮糖 -5-磷酸和 2-甲基 -D-赤藓糖1 24-136 页1醇-4-磷酸的合成 方法hybrid14Recognitionandbindingof RSC AdvancesLi Qian,Duan 3.112016 年 6卷voltage-dependentanionchannel-1Meijiao, Li Shasha,1-28with ATP and NADH by spectr

18、oscopicZhang Yeli,Qiaoanalysis and molecular dockingPan, Bian Liujiao*15Recognitionandbindingof lactamLi Qian, Zhang 2.602016 年 1014antibioticstobovine serumalbuminJ. Chromatogr.Tianlong,Bian卷 90-101 页by frontalaffinitychromatography inLiujiao*Bcombinationwithspectroscopy andmolecular docking16Bindi

19、ngofangiogenesisinhibitorJ. Chromatogr.Bian Liujiao, Li 3.982015 年 1401kringle 5toits specificligands byAQian, Ji Xu卷 42-51 页frontal affinity chromatography2016-2-边六交李倩李倩，00是2-1-1417段美娇，李莎莎，张椰莉，乔盼，边六交2016-4-边六交李倩李倩，14是2-1-151张天龙，边六交2015-7- 边六交边六交边六 24是2-1-163交，李倩，冀旭17IsolationandpurificationofBiomed

20、.BianLiujiao*,1.612015 年2015-1 边六交边六交边六 00是2-1-17monosialo-tetrahexosylgangliosidesChromatogr.Yang Jianting, Sun29卷0-1交，杨from pig brain by extraction andYu1604-1611建婷，liquid chromatography页孙玉18IsolationandpurificationofBiomed.BianLiujiao*,Ji1.612014 年2014-7-边六交边六交边六22是2-1-18recombinant humanplasmino

21、genChromatogXu, Hu Wei28卷1交，冀Kringle 5by liquidchromatography957-965 页旭，胡and ammonium sulfate salting-out伟19Temperature-inducedconformationalBiomed.BianLiujiao,Wu1.612014 年2014-2-边六交边六交边六24是2-1-19transition of bovine serum albumin inChromatogr.Dan, Hu Wei28卷1交，吴neutralaqueoussolutionby295-301 页丹，胡re

22、versed-phase liquid chromatography伟20Urea-induced dissociation of nerveChromatograpBianLiujiao,Ji1.402014 年2014-6-边六交边六交边六02growth factor from venom of ChinesehiaXu, Hu Wei77 卷1交，冀cobra by SEC793-802 页旭，胡伟合 计3975补充说明七、主要知识产权证明目录：序号知识产权类别知识产权具体名称1发明专利化学法-酶法制备1-脱氧 -D- 木酮糖5-磷酸的方法2发明专利1-脱氧 -D- 木酮糖5- 磷酸还

23、原异构化酶抑制剂及其衍生物的制备3发明专利中药黄芩中黄酮类化合物作为 DXR 抑制剂的用途4发明专利一种高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle5 三聚体的高效表达方法5发明专利人源基质细胞衍生因子 1 的表达载体、构建方法及应用 .国家授权号（地区）中国ZL2010101009 749中国ZL2012103914 65.5中国ZL2013104419 96.5中国ZL2010102987 71.5中国ZL2013102535 58.6授权日期证书编号权利人发明人专利有效对应附状态件编号2013-11-061300744西北大学高文运；田有效3-1洁；廖娟； 李恒；王雪娇；戴少波2014-04

24、-091380148西北大学高文运；郝保有效3-2华；惠先； 李恒；董磊2015-10-211820593西北大学高文运；李有效3-3恒；董磊； 闫格；田方琳1208409西北大学边六交；妙亮有效3-42013-06-052015-10-2118118013西北大学边 六 交 ； 蔚有效3-5萍；冀旭； 候俊八、客观评价：项目组研究开发的血管生长抑制剂Kringle 5是一种新型生物药物候选蛋白，目前处于研究开发阶段。借助国家科技重大专项项目（基因重组血 管 生 长 抑 制 剂Kringle5 的 中 试 生 产 工 艺 和 药 用 研 究 ，2009ZX09103-696）的实施，项目组已建

25、立了血管生长抑制剂Kringle 5 的发酵培养和分离纯化中试生产线一条，已经能够规模化生产出纯度和活性都满足药用的合格的用于研究用的血管生长抑制剂Kringle 5 制剂，初步建立了重组血管生长抑制剂Kringle 5 的生产质量标准；初步完成血管生长抑制剂Kringle 5 的主要药效学、药代动力学和药理学研究和安全性评价。除国家科技重大专项支持外，该项目目前还获得国家自然科学基金一项及若干项省部级项目的资助，获得国家发明专利两项。项目组关于 DXS酶及其催化 DXP合成方法的研究已得到国内同行专家的认可，利用该方法已为武汉大学生命科学学院及中国林业大学草坪研究所的相关老师制备了未标记及

26、13C-DXP。在对 DXR 的研究中，项目研究人员也提出了该酶新的底物结合方式及催化循环， 发现了一些该酶的新抑制剂。该项目目前已获得国家自然科学基金三项及若干项省部级项目的资助，获得国家发明专利三项。关于 Kringle 5 及hSDF-1的研究：项目组获得了用以高效表达 Kringle 5 的基因工程菌株，制备了融合的和非融合的目标蛋白 Kringle 5 ，进行了重组 Kringle 5 候选蛋白药物的成药性研究，旨在为将其开发为具有自主知识产权的候选 I 类生物新药做出贡献。建立了 hSDF-1原核表达、包涵体柱外复性和阳离子交换柱一步法分离纯化方法，高效地获得了纯度较高的目标蛋白，为该蛋白的主要药效学、药代动力学及药理学研究和安全性评价方面的研究打下了坚实的基础。关于 DXS及 DXR 的研究：DXS：在获得了稳定的 DXS酶来源的基础上，项目组以该蛋白为催化剂建立了多个 DXP（萜类化合物 MEP生物合成途径关键中间体）的简单高效的制备方法，其中一个方法目前已获得专利授权，另一个方法被 John Whitthall 和P. W. Sutton编纂的专著收录（ Jie Tian, Heng Li and Wen-Yun Gao, Improved Enzymatic Preparation of DXP, in Practical Me