p53基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证

1、p53基因3UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证p53基因3UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证4942202101-0001-04Construction of Dual-Luciferase ReporterPlasmids by 3UTR Region of p53 Gene andTheir Targeted Relationship with miRNA-2127Zhang Yuxia， Yuan Xiaoyuan， Wang Youling， Meng KaiInstitute of Poultry Science

2、s， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250023， ChinaAbstractTo verify the targeted relationship between miRNA-2127 and p53， the binding sites of p53 and miRNAs-2127 were predicted by bioinformatics software. The wild-type and mutant templates of the binding sites were synthesized by the

3、 whole gene synthesis method， and were cloned into pmiR-RB-REPORTTMdual-luciferase reporter vector to construct the wild-type and mutant-type recombinant dual-luciferase reporter plasmids. The cultured monolayer 293T cells were divided into 4 groups including co-transfected wild-type reporter plasmi

4、d + NC control， co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127， co-transfected mutant reporter plasmid + NC control and co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127， respectively. The difference of luciferase activity in each group was detected. The results showed that compared with c

5、o-transfected wild-type plasmid + NC control， the relative luciferase activity of 293T cells in the group with co-transfected wild-type plasmid + miRNA-2127 showed a significant decrease P0.05， and that of co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127 group was significantly higher than co-tra

6、nsfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127 group. The results indicated that miRNA-2127 could targeted regulate p53 and the binding sites were located between 369 and 375 in the 3 UTR region.Keywordsp53; miRNA-2127; Dual-luciferase reporter systemp53蛋白是一種细胞核磷酸蛋白，能调控细胞生长与基因转录，被认为是一种在很多细胞进程中起到关键

7、调控作用的因子。近年来的讨论发觉，p53蛋白除了具有肿瘤抑制功能外，其在机体抗病毒免疫反应中也起着重要作用1。微小RNAmiRNA是一类非编码小RNA分子，长度约1925 nt，普遍存在于真核细胞内，在进化过程中高度保守，其在细胞增殖、凋亡、应激应答及新陈代谢等多项生理过程中发挥重要作用。讨论说明，miRNA调控着p53基因的表达2。Le等3将斑马鱼脑组织中的miR-125b敲除以后发觉p53蛋白水平明显上调，miR-125b是p53的负调控因子，miR-125b通过直接作用于p53的3UTR区在转录水平上调控p53的表达，并诱导细胞凋亡过程。之后，又有讨论陆续证明miR-1285、miR-1

8、25a、miR-33和miR-5044均可直接作用于p53的3UTR 区，从而在转录水平上负调控p53蛋白的表达。 1.8统计学处理数据接受SPSS软件进行单因素方差分析和t检验，比较4组细胞中荧光值的差异。2结果与分析2.1p53基因野生型及突变型报告质粒的PCR鉴定随机挑取突变型和野生型菌落，进行菌液PCR鉴定，扩增的条带理论大小为636 bp，其实际扩增条带如图1所示，与预期片段大小一致。2.2p53基因野生型及突变型报告质粒测序结果由图2测序结果可见，已胜利将靶序列ACTGAAA 369375突变为TGACTTT。2.3各组细胞中荧光素酶活性改变一般条件下，miRNA跟NC对比相比，野

9、生型载体报告荧光有所下调，则认为miRNA对报告基因有调整作用5。由图3可见，miRNA-2127+野生型报告质粒组293T细胞中的相对荧光素酶活性较NC+野生型报告质粒组显著降低P0.05，证明miRNA-2127能有效抑制野生型质粒荧光素酶的活性;miRNA-2127+突变质粒报告组293T细胞中的相对荧光素酶活性显著高于miRNA-2127+野生型质粒报告组P0.05。证明miRNA-2127质粒无法抑制突变型荧光素酶活性。因此说明miRNA-2127与预报到的p53基因3UTR位点有明显的互相作用。3討论与结论p53基因是迄今为止已发觉与肿瘤发生相关性最高的基因，野生型p53基因通过调

10、控细胞周期内的增殖、分化和凋亡来维持生物机体内基因组和细胞的稳定，可抑制肿瘤生长，而突变型p53基因则能促进肿瘤的发生进展，诱导原位癌的形成，该突变位点可应用于肿瘤的早期诊断6。p53蛋白除了作为热门的肿瘤抑制蛋白被大量讨论之外，还被发觉是宿主自然免疫因子，其对不同种类病毒复制的抑制作用不断被证明。2021年Takaoka等7首次报道p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，讨论还发觉p53蛋白能够抑制新城疫病毒8、传染性法氏囊病毒9、脊髓灰质炎病毒等的复制。2021年，Voorhoeve等10在筛选人miRNA时首次发觉miRNA参加p53信号通路，是p53信号通路调控网络中的关键分子，miRNA通过特异结合mRNA，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而参加调控细胞的生长与凋亡。因此通过挖掘调控p53的miRNA，可为宿主抗击疾病提供更深层次的解读，也可为开发更广谱的抗肿瘤和病毒的基因药物奠定基础。构建合适的报告载体，对增加或降低p53蛋白含量