中国药典微生物检验规程

1、微生物检验规程1. 实验注意事项1.1 无菌操作要求1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。1.1.2 专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球将手擦干净。1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸

2、管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。?1.2 无菌间使用要求1.2.1 ? 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。?1.2.2 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min ，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。?1.2.3 处理和接种样品时，进入无菌

3、间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。1.3 消毒灭菌要求1.3.1 灭菌前准备（ 1 ）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3 （例如500mL的三角瓶最好装 300350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。（ 3 ）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。1.3.2 装放（ 1 ）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（ 2 ）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。1.3.3 设备检查（ 1 ）检查门的开关是否灵

4、活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（ 2 ）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。（ 3 ）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。1.3.4 灭菌处理（1） 干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60以下才能打开箱门。（2） 立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到零时，自然冷却至60 后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60 以下再开盖取物，以防突然减压液体

5、剧烈沸腾或容器爆破。（ 3 ） 物品取出, 随即检查包装的完整性, 若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者, 不可作为无菌物品使用。培养基或试剂等, 应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态, 未达到者应废弃。取出的物品掉落在地或误放不洁处 , 或沾有水液, 均视为受到污染, 不可作为无菌物品使用。取出的合格灭菌物品, 应存放于贮藏室或防尘柜内 , 严禁与未灭菌物品混放。凡属合格物品, 应标有灭菌日期及有效期限。1.4 有毒有菌污物处理要求1.4.1 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌（经微生物污染的培养物，必须经121 30min 高压灭

6、菌）。1.4.2 染菌后的吸管（即进行阳性菌操作后的），使用后放入5 %煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h （消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121 30 min 高压灭菌。1.4.3 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。1.4.4 打碎的培养物，立即用 5 %煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。1.4.5 污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌

7、后方能洗涤。?1.5 培养基制备要求1.5.1 根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。1.5.2 因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量。1.5.3 盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧瓶）为好。1.5.4 每批培养基制备好后，应做无菌生长试验（空白平皿试验）及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4冰箱存放。2. 实验操作2.1 准备用具，配制培

8、养基、稀释液、培养箱：需氧菌菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基、霉菌和酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基控制菌胰酪大豆胨液体培养基肠道菌增菌液体培养基麦康凯液体培养基RV 沙门增菌液体培养基接种平板紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 麦康凯琼脂培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基： 0. 9% 无菌氯化钠溶液2.1.4 培养箱：3 个（30?35、20?25、42?44）2.2 培养基配制2.3 灭菌2.4 无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养24 至 48 小时，以检查灭菌是否彻底。2.5 无菌室准备：用消毒液擦拭无菌室，将本次试验所用的器皿、培养基通过传递窗送到无菌室，样品置于传递窗，一次性使用物料（

9、工作服、口罩、手套）置于缓冲间。开启净化系统1 小时，关闭净化系统，打开紫外灯 0.5 小时，关闭紫外灯，至少0.5 小时后进入无菌室。2.6 微生物计数检验（平皿倾注法）：一般供试品的检验量为10g 或 10ml; 膜剂为 100cm2; 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从 2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。： 0. 9% 无菌氯化钠溶液： 3 个稀释级（常用10-1 、 10-2、 10-3） （每稀释级每种培养基至少制备2 个平板），同时做空白（等量稀释剂）供试液用量为适应性试验确定的，常用1ml 取培养基，融化并让其冷却

10、至45c左右，倾入已加入供试液的平皿中，每个平皿约 15mL （即倾倒时液面刚刚闭合时），在超净台面上轻轻晃动使供试液均匀混合于培养基中，放置一旁待冷却凝固。2.6.4 培养：待平皿完全冷却凝固，通过传递窗取出，倒置叠放置于培养箱中。培养时间及温度：需氧菌菌总数30?35培养3?5 天霉菌和酵母菌总数20?25培养5?7 天，2.7 控制菌检验取供t品10g,用稀释剂制成1 : 10供试液，混匀，在 20?25c培养约2小时（可以在无菌室中先做这一步，等其余试验步骤完成，再继续进行控制菌的下一步）。耐胆盐革兰阴性菌胰酪大豆胨液体培养基大肠埃希氏菌0. 9%无菌氯化钠溶液沙门菌直接取样品10g

11、或 10ml（增菌培养）：取供试液10mL （相当于1g 样品），加在ml 增菌液体培养基（经方法适用性试验确定）中， 30?35培养 24?48 小时。耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基大肠埃希氏菌胰酪大豆胨液体培养基沙门菌胰酪大豆胨液体培养基:取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001tnl）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积 （经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30?3 5培养24?4 8 小时。肠埃希氏菌：l ml 接种至 100 ml 麦康凯液体培养基中，42?44 培养24?4 8 小时。沙门菌：0.1 ml 接种至

12、10mlRV 沙门增菌液体培养基中，30?35培养 18?2 4 小时。2.7.4 平板划线分离培养（1）培养基平板的准备：取培养基，融化并让其冷却至50 c左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL,使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。耐胆盐革兰阴性菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基大肠埃希氏菌麦康凯琼脂培养基沙门菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（ 2）各种物品的准备取出预培养后的控制菌供试液，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、一次性接种针、火柴、酒精棉球、试管架等。可在阳性菌室或无菌室操作，无菌室准备工作相同。（ 3 ）平板划线以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底, 拇指和食指打开上盖

13、，使盖与底成30°角，以便划线。右手握一次性接种针，把接种针上的菌液涂在培养基一侧，一般作5-8 次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1 次划线引出第2 次划线；再从第2 次划线引出第3 次划线，如此反复3-4 次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2 次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。30?35培养18?24 小时。2.8 培养物的观察2.8.1 需氧菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。2.8.2 霉菌和酵母菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。2.8.3 大肠埃希菌：每天观察菌落的

14、生长情况。2.8.4 沙门氏菌：菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。如有疑似菌落则用接种针挑选于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18?2 4小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。3. 数据报告3.1 平皿法：点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。3.2 控制菌3.2.1 耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管

15、检查结果，从表2 查 l g 或 lm l 供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。3.2.2 大肠埃希菌：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑

16、色，判供试品未检出沙门菌。3.3 报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于l00cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最高的平均菌落数，计算lg、lmL或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。3.4 结果判断：101 cfu:可接受的最大菌数为20102cfu ：可接受的最大菌数为200103cfu:可接受的最大菌数为2000,依此类推。3.5 限度标准：需氧菌总数103cfu （ 200

17、0）102cfu （V 200）霉菌和酵母菌总数102cfu （ 200）101 cfu （ 20）大肠埃希菌不得检出沙门菌（含脏器提取物的）不得检出 需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数 大肠埃希菌 沙门菌（含脏器提取物的）不得检出 耐胆盐革兰阴性菌 需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数 大肠埃希菌不得检出104cfu (< 20000)102cfu (< 200)不得检出不得检出< 102105cfu (< 200000)5X 102cfu (< 1000)不得检出5X 10 cfu (< 1000)102 cfu (< 20)103cfu (< 2000)102 cfu (< 200)沙门菌（含脏器提取物的）不得检出耐胆盐革兰阴性菌1014. 实验时间安排4.1 第一天：准备用具、培养基、稀释剂，灭菌4.2 第二天：准备无菌室（预计2小时），检验（无菌室操作预计3 小时），平皿冷却（夏季预计2 小时，冬季预计 1 小时），移出无菌室进行培养（预计0.5 小时）4.3 第三天：观察培养物（需氧菌菌总数、霉菌和酵母菌总数第一天），耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门氏菌的预培