石蜡切片的制作

1、个人收集整理仅供参考学习石蜡切片的制作石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织 学、病理学等常规制片方法，它有很多优点，例如，比较省时间，容易操作，可 切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存等。 缺点是 只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好容易破碎， 组织在脱水透明过程 中产生收缩并易变脆，制片时间太长。一、石蜡切片的制作过程石蜡切片的制作过程主要是：取材一水洗一固定一水洗一脱水一透明一浸蜡一 包埋一切片一贴片一染色。（一） 取材及水洗根据实验要求选取材料来源及部位， 取要求部位的小块组织成为组织块， 组 织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜

2、。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引 或挟持，以免组织内部发生变化。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越 新鲜越好，一般不应超过死后 24小时，因此一般情况下，将动物处死后立即取 需要的材料。 个人收集整理 勿做商业用途组织块取下后，先用相应的生理盐水漂洗以洗去血液、 污渍以及粘液等。如 果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐 水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。个人收集整理勿做商业用途（二）固定材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内 部，将组织固定以保持其原有的结构Q不同的纲织应选用适当的固定液。固定 液的用量

3、与组织块体积之比一般在 20:1 ,不应使组织块贴于容器壁上。材料固 定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，应记录固定 液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。固定的时间长短依据材料 大小而定。 个人收集整理勿做商业用途固定液有许多种，在固定的过程中应该根据需要选取合适的固定液， 一般固 定液都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变 化而失去固定作用。有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在 使用前才混合，如果混合太早固定时就没有作用了。 个人收集整理勿做商业用途（三）水洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液，主要目

4、的是洗去 固定液的颜色以便后续的染色。水洗时，一般将其置于水龙头下以自来水流水冲 洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出， 洗得更干净彻底，有些还需要进行特 殊的洗涤。个人收集整理 勿做商业用途（四）脱水固定之后的组织要进行脱水。由于组织内的水不能和支持剂混合，所以必须 把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保 存。乙醇既可做固定剂也可做为脱水剂，再用酒精脱水的过程中，首先用 50% 的酒精进行脱水，然后再依次增加酒精浓度，直到最后用100%的酒精进行脱水。 如50% T0%70%80%90%95% T00% ,使用100%的酒精可以脱水两次 到三次。脱水的时间应该

5、视组织块的大小而定。脱水必须彻底，否则不易透明， 甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 个人收集整理勿做商业用途（五）透明透明是石蜡切片法切片前必经的一步，其目的主要是置换组织内的脱水剂， 为下一步的浸蜡起到桥梁作用，并且使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光 线的透过。最常用的透明剂主要是二甲苯，它既能与酒精混溶，也可以任意比例 与石蜡混溶。在透明过程中，先用等比例混合的二甲苯和纯酒精处理一段时间， 再用二甲苯进行处理二到三次即可。 用二甲苯处理的时间不可过长，否则组织容 易变脆。但是透明也必须彻底。 个人收集整理勿做商业用途（六） 浸蜡与包埋浸蜡的目的主要是置换组织中的透明剂， 为包埋做准备。

6、在浸渗前要先将选 好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中， 使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬 蜡两种，冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。浸渗应在自动包 温箱中进行。浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中， 待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷 却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框 盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。个人收集整理勿做商业用途（七）切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台， 将其固定在切片机上，使蜡块切面 与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片

7、质量， 按照一定的频率切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。切片可以是单 张，也可以是连续切片形成蜡带。 个人收集整理勿做商业用途（八）贴片粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步 骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45 c左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸储水于载玻片上， 再把蜡片放于水 滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45 c温箱中干燥，也可在37c温箱中干燥，但需适当延长时间。 个人收集整理勿做商业用途（九）染色为了观察组

8、织内部的细微结构，必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的 染料对组织进行染色，否则有碍观察。普通的染色法有两种即苏木精伊红染色法， 染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色，另一种方法为铁苏木紫染色，染色 的结果是全部着以深浅不同的蓝色。制作石蜡切片时最常用的染色方法是苏木精 伊红染色法。个人收集整理勿做商业用途二、固定的目的制作石蜡切片时，在取材并且洗净之后应该迅速固定， 其目的主要是使组织 液渗入到组织内部杀死组织中的各种酶， 保持细胞原有的结构，使观察出来的结 果更加贴近实际，研究更加方便。而且固定能使组织硬化，有利于切片的进行， 而且也有媒浸作用，有利于组织着色。个人收集整理勿做商业用途

9、三、染色的机理石蜡切片制作过程中主要使用的是苏木精-伊红染色法，即HE染色法。苏 木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色； 伊红为 酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。 个人收集整理勿做商业用途易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性和嗜酸性； 组织内构成蛋 白质的氨基酸种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱 度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的5 / 6个人收集整理仅供参考学习粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞 质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、 嗜酸粒细胞

10、的颗粒及胶原纤维和肌纤 维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。 个人收集整理勿做商业用途去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红 Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离 解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色， 与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。由于组织或细胞的不 同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙 盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝， 如处理适宜，可使细胞 核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆 的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。 一般的组织变化和组织产物都可以 通过这一染色法显示出来，是形态学最常用的染色方法。个人收集整理勿做商业用