菌种传代与复苏

1、菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌 试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力， 在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(或 CMCC(B)CMCC-中国医学菌种保藏中心，、，B-代表细菌，F代表真菌。金黄色葡萄球菌 CMCC(B)2600次肠本f菌CMCC(B)44102枯草芽 孢 杆 菌 CMCC(B)63501 白 色 念 珠 菌 CMCC(F)98001 黑 曲 霉 CMCC(F)98003传代和接种菌种冻

2、干粉复苏把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂

3、斜面进行培养。菌种斜面传代操作培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30 分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30 秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3 次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种

4、环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存大肠杆菌35-37 摄氏度培养48 小时金黄色葡萄球菌30-35 摄氏度培养48 小时 枯草芽孢杆菌30-35 摄氏度培养48 小时白色念珠菌23-28 摄氏度培养7 天 黑曲霉 23-28 摄氏度培养7 天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8 摄氏度）保存，一菌悬液的制备般 2 个月转种一次。取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，

5、已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37 摄氏度培养18-24 小时， 取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml,加到9ml %无菌氯化钠溶液混匀，为 10-1 ， 再取另一只刻度吸管吸取10-1 菌液 1ml加到%无菌氯化钠溶液中混匀，为10-2 以此类推，稀释至含活菌数在 50-100 个。用平板计数。此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。记录 传代和接种使用后，应做好菌种传代接种记录。菌悬液制备后，应做好菌液制备使用记录。依据 : 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1. 标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（

6、ChinaMedical culture collection ,CMCC ）提供的冷冻干燥菌种（0 代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3 代） 。黑曲霉的0 代菌种为保存于含15%甘油的%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 CMC（B）代表细菌（bacteria ） ,CMCC（F代表真菌（fungi ）每种菌具有固定的代号。2. 标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记

7、上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0 代原始菌种储存于20， 有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（ 3代）应检查菌种管是否完好。储存于 28 C,有效期为3个月。3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球培养基改良马丁琼脂培养基: 用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基: 用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基: 用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、 乙型副伤寒沙门菌、短小

8、芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培养基: 用于白色念珠菌复苏、复壮.操作步骤：a. 打开洁净工作台。b. 在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。c. 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开 启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）d. 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移 取ml到安甑中。e. 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。f. 用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。g. 根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度3035C,培养1824小时；真菌培养温度 2328C,培养3

9、5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7 天，真菌应延长培养时间至14 天，若仍未浑浊，灭菌处理。h. 黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置2328C培养57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有%（ ml/ml ）的吐温 -80 的 %无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i. 取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml 至液体培养基中按g 项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%勺无菌甘油混匀，1-2ml/ 管分

10、装于冻存管。每个菌种制备10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h 项下洗脱液按h 项下方法进行复壮，制成复壮后的抱子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、 30%的无菌甘油混匀，1-2ml/ 管封存于冻存管。制备10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j 储备菌种管制备成功，储存于20，有效期为三年。菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营

11、养琼脂培养基平板上， 或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在3035c下培养23天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠 琼脂培养基平板，并在2328 c下培养7天；培养后，观察其菌落 形态，应符合该菌种形态特征。污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。 将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0 代， 冷冻干燥的原始菌种开启

12、后转种后为第1 代，直到第3 代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 代。菌种的传代保藏过程项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3 代。 工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代（W3），一类用于实验用（S3） 。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（ 1） 从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30 分钟。（ 2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。（ 3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌

13、种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。（ 4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。（ 5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。（ 6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将

14、接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。（7）将已接种好的细菌管置3035 c细菌培养箱培养 2224h,真菌管置2328c真菌培养多f最多培养7天。当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转 接下一代工作用菌种，如：(W3可直接车接为(W4。按上述程序操 作，直至(W4转为(W5为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销 毁。菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间大肠埃希菌(CMCC(B)44102)3035 c 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)3035 c 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月枯草芽抱杆菌(CMCC(B)63501)3035 c 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)3035 c 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)3035 C 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月生抱梭菌(CMCC(B)64941)3035 C 2224h营养琼脂培养基2c8 C保存3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001)2328 c最多7天改良马丁琼脂培养基2c8 C保存3个月黑曲霉(CMCC(F)98003)2328 c最多7改良马丁琼脂2c8 C保存3天培养基个月短小芽抱杆菌(