喜树组织培养体系建立

1、精选优质文档-倾情为你奉上喜树组织培养体系建立生工131- 陈驰摘要：喜树(Camptotheca acuminata)是珙桐科(Nyssaceae)的一种落叶阔叶树，为优良的园林绿化树种，喜树还可以产生具有抗肿瘤作用的喜树碱。分布于我国长江流域及西南各省和印度部分地区，我国台湾、广西、河南等地也有栽培。喜树不仅是绿化树种，也是具有抗癌功效的药用植物。本文概述了喜树组织培养中不同外植体的选择方法；总结了培养条件中外植体的处理，激素和培养基的选择，以及附加物的添加。关键词：喜树；组织培养；研究进展；愈伤组织；带芽茎段，茎尖；再生。喜树(Camptotheca acuminata Decne)为珙

2、桐科(Nyssaceae)喜树属(Camptotheca Decne)植物，又称旱莲木，是我国特有的植物，分布于长江流域及西南各省。喜树不仅是一种优良的绿化树种，也是药用价值非常高的药用植物。1966年美国科学家Monroe Ewall首先发现喜树中含有一种次生代谢物质喜树碱(Compothecine，CPT)，该物质具有抗肿瘤活性。20世纪80年代后期，喜树碱抗肿瘤作用靶点作用机制被揭示后，有关喜树的研究成为了国内外生物学领域的研究热点。喜树以种子繁殖为主。 喜树种子以风力和重力为扩散动力， 降雨及鼠类可引起微弱的二次扩散。 扩散从9 月上旬开始一直延续到次年8月末， 但其有效扩散时间为10

3、月至次年3月。扩散距离越大，种子远距离分布的数量及其发芽率迅速降低。采取植物组织培养法进行喜树的快速繁殖，有利于提高喜树种子的利用率，扩大繁殖系数。1. 植物组织、细胞培养的应用研究植物组织培养(plant tissue culture)是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工配制的培养基上，在适当的培养条件下，使其长成完整植株的过程。据培养对象的不同可分为：植株培养、胚培养、器官培养、细胞培养、原生质体培养。植物组织和细胞培养是建立在植物细胞全能性的理论基础上的。某部分的体细胞脱离其原来器官或组织，在一定培养条件下，表现出全能性。全能性的实现除了取决于它在原来所处

4、的自然部位上已达到的细胞分化程度和生理状态，还必须满足将其处于独立发育的离体培养条件下，并且赋予细胞一定刺激，即营养物质、激素等调控物质。实现植物再生有两条途径：体细胞胚胎发生途径和器官发生途径。通常器官发生是组培再生的主要途径。组培法进行无性繁殖可通过多种方法实现。主要有腋芽增殖、不定芽增殖、胚状体增殖。其中腋芽增殖途径变异小，常用于珍稀优良品种的繁殖和保存，但增殖速度慢。胚状体增殖速度快，多用于人工种子和遗传转化研究，但易产生畸形胚。不定芽增殖方法多样，可直接从外植体上分化产生不定芽也可脱分化形成愈伤组织后进而器官分化形成不定芽；还可由悬浮细胞或是原生质体分裂、生长、分化经器官发生和体细胞

5、胚胎发生途径再生植栋。在组织培养研究中影响因素是多方面的，主要是来自：(1)培养材料的种类、所取外植体的部位与生理状态。(2)培养基的种类和激素的配比与浓度。(3)培养条件(包括温度、湿度、光照与通气)。组织培养起步于50年代初期，主要用于快繁脱毒、植物育种(单倍体培育、胚胎培育、原生质体培养与细胞杂交)、生产有用次生代谢产物、人工种子、种质保存等。目前通过组织培养能再生的植物种类已有130个科，1500个种。2. 培养条件的选择2.1外植体处理外植体处理的方法有很多。种子、幼叶、茎段等外植体，经过蒸馏水清洗、酒精消毒、01HgCl，或5NaCl0，消毒、再次蒸馏水清洗后，将种子剥取种胚或切取

6、胚轴，或将幼叶和茎段切成合适大小，接种到培养基上，后置于25的恒温培养箱中培养，每天光照12 h，光照强度1 5002000lx。消毒剂对外植体进行消毒时，消毒时间的长短会影响到接种后的污染情况。使用酒精进行消毒，酒精浓度一般为7075，消毒时间为30 s左右；使用01HgCl，消毒，时间为3。10 min为宜；使用5NaCl0，消毒，时间为5 min左右。种子的消毒时间要长于幼叶和茎段的消毒时间。叶片和茎段等切块的大小也会对组织培养产生影响。外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害和褐变的程度就越大，因此，用完整的叶片作为外植体比切成小块产生褐变的几率小。研究员认为，叶片剪成15 cm

7、5;15 on的小块作为外植体培养综合效果最佳。22培养基与激素在喜树组织培养中常用的培养基有MS、I2MS、改良MS、B5、N6、SH、WPM和VW培养基，常用的激素有NAA、6-BA、2,4一D、IBA和KT。激素主要分为生长素类和细胞分裂素类，外植体培养过程中所添加各激素的比例不同，所产生的促进效果也一样。生长素类激素添加浓度高时有利于根的发育，添加浓度比例低时则有利于芽的发育。苯基噻二唑基脲(Thidiazuron，TDZ)是一种人工合成的化合物，具有植物生长素和细胞分裂素的双重作用，最近在植物组织培养上得到了较多应用。研究表明，TDZ在喜树愈伤组织培养中可替代植物激素，添加1 mgL

8、的TDZ最适合组织生长，添加1 mgL的TDZ+05 mgL的NAA可显著促进愈伤组织的生长及叶绿素的积累。根据研究目的和选用外植体的不同，所选用的培养基和激素也不一样。WPM是根据木本植物的特点而创出的一种木本植物利用的培养基。以喜树的幼叶为外植体，以WPM为基本培养基，得到芽诱导的最佳激素组合为的6一BA 198斗molL+NAA 58¨molL，根诱导的最佳激素为IBA 96 ILL rnolL，建立了较好的植株再生系统。高桂珍等口01发现，以B5或White培养基与NAA 05 mgL+KT 01 mgL组合来进行喜树悬浮培养效果最佳。用喜树带芽茎段为外植体，通过正交试验分析

9、得出影响愈伤组织诱导率的主要因素是BA。研究发现，MS培养基对根的形成表现出一定的抑制作用，12MS和WPM培养基则适合喜树组培苗生根。23附加物的添加木本植物常常含有较多的酚类化合物，在组织培养中外植体或愈伤组织释放的酚类化合物被多酚氧化酶氧化成醌类物质，而这些物质分泌到培养基中可导致整个组织褐变坏死。通过添加一些抗氧化物，可以抑制这些褐化现象的产生。在以喜树离体胚为外植体诱导芽增殖的培养基中加入30 mgL的柠檬酸，其愈伤组织诱导率可达95芽增殖系数达到62，起到较好的抑制褐化的效果。在培养基中添加活性炭、抗坏血酸，有效地抑制了愈伤组织继代培养中的褐化。3继代与再生培养组织培养中培养基营养

10、和水分会减少，并积累了一定的代谢产物，根据外植体初代培养的情况，一般在30 d左右需进行继代培养。随着愈伤组织的增殖或芽苗的增多，可将愈伤组织或芽苗切割后扩增繁殖。继代培养基根据需要可与初代培养基相同，也可不同，若进行分化培养，可在初代培养基基础上添加特定激素来进行芽的诱导或根的诱导。实验小组将初代培养的愈伤组织在MS+6一BA 10 mg+2牟D 10 mgL的培养基上继代培养，愈伤组织生长迅速。刘菲等126l发现在MS+6一BA 20 mgL+NAA05 mgL的培养基上继代培养出的愈伤组织适合于细胞悬浮培养。3.1 细胞悬浮培养体系的建立取连续继代4次、质地疏松易碎的愈伤组织，接种于附加

11、2O mg，L 6BA和O5mL，NAA的MS、sH、B5液体培养基中进行悬浮培养，观察培养物状态，测定细胞生长量及喜树碱含量。悬浮培养条件：pH值约58，摇床转速120 rmin，100 mL三角瓶中液体培养基为80 mL，接种量约为20 gL，培养周期为20d。总结喜树在我国的资源十分有限，通过采伐野生喜树资源提取药用成分会使成本过高，并破坏生态环境，因而不能有效且节能的实现。通过喜树组织培养体系的建立会使这一情况得到良好的解决。随着喜树组织培养和再生繁殖技术的不断深入，已经可以应用喜树茎尖、茎段、种胚、叶片等外植体通过愈伤组织或直接芽、根的诱导，经过壮苗移栽，从而得到喜树的再生体系，为喜

12、树药用成分含量提取和工业化等研究奠定了基础。以喜树幼叶为外植体，在不同的培养基上均可诱导出愈伤组织，从生长情况来看，作为基本培养基对愈伤组织的形成更为有利。不同激素对诱导愈伤组织往往有不同的效果，诱导产生的愈伤组织在形态结构、生长能力、分化方向、次生代谢产物的合成能力等方面有很大差异。2，4D较易诱导出愈伤组织，但不利于组织的分化。而NAA对喜树愈伤组织分化成胚状体有促进作用。多种激素组合比单激素更有利于诱导出愈伤组织。从薄层层析的结果可初步判断分化出的胚状体含有喜树碱，愈伤组织分化成胚状体与次生代谢产物c盯的产生有一定的相关性。参考文献【1】陈晓亚。叶和春植物次生代谢及其调控植物科学进展(第

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