维拉帕米对大鼠肝脏低温保存再灌注损伤的防护机制

1、维拉帕米对大鼠肝脏低温保存再灌注损伤的防护机制             作者：高昌俊，李开宗 ，管文贤 【关键词】  肝移植关键词: 肝移植;维拉帕米;器官保存;再灌注损伤 摘 要:目的  在自制的器官保存液XJ-1液已取得较好结果的基础上，探讨维拉帕米对大鼠肝脏低温保存再灌注损伤的防护作用及其机制. 方法  XJ-1液与XJ-1+维拉帕米液保存大鼠肝脏18h后施行肝脏移植，检测术后血清转氨酶水平、肝组织钙离子及丙二醛含量等指标，观察大鼠术后1wk存活率及

2、移植肝脏的组织病理学改变. 结果  XJ-1+维液保存的大鼠肝脏移植后4h，血清ALT，AST水平、肝组织钙离子含量、丙二醛含量均显着低于XJ-1液组（P0.01，P0.05），光镜与电镜下肝组织形态学改变较XJ-1液组好，同时术后生存状况及1wk存活率也优于XJ-1液（71%vs57%）. 结论  维拉帕米能够减轻肝脏体外保存再灌注损伤，明显增强了XJ-1液对大鼠肝脏的保存效果，原因在于其阻滞钙通道的钙离子拮抗作用.   Protective mechanism of verapamil on rat liver grafts under cold p

3、reservation and reperfusion   GAO Chang-Jun ，LI Kai-Zong，GUAN Wen-Xian   1 Department of Anesthesiology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xian710038，China，2 Department of Hepatobiliary Surgery，Xi-jing Hospital，Fourth Military Medical University   Keywor

4、ds:liver transplantation;verapamil;organ preserva-tion;reperfusion injury   Abstract:AIM To investigate the protective effect of vera-pamil on rat liver grafts under cold preservation and reperfu-sion and its mechanism on the basis that we had achieved good effects on rat liver preservatio

5、n using self-designed XJ-1solution.METHODS Rat orthotopic liver transplants were performed with livers preserved for18h in XJ-1solution and XJ-1+V solution.Serum ALT，AST levels and liver tissue  concentrations of calcium and malondialdehyde（MDA）were measured.Histological changes of liver were s

6、tudied.The rats status and1-week survival rates after transplantation were observed.RESULTS The levels of serum ALT，AST，concentrations of Ca2+ and MDA were significantly lower in XJ-1+V solution group than those in XJ-1solution group at4h after transplantation（P0.01，P0.05）.Histological-ly，livers of

7、XJ-1+V solution group showed less damage，and1-week survival rate was higher compared with that of XJ-1solution group（71%vs57%）.CONCLUSION Vera-pamil can reduce preservation and reperfusion injury，and im-prove the effects of XJ-1solution on rat liver preservation due to its Ca2+ channel blocking effe

8、cts.   0 引言   肝移植术后原发性无功能（PNF）是肝移植的主要死亡原因之一，与肝移植体保存-再灌注损伤密切相关1 .我们曾自行配制一种新的器官保存液XJ-1液，已成功地用于大鼠心脏的保存，但在保存大鼠肝脏方面逊于UW液2 .由于肝脏缺血冷保存过程中钙超载是导致肝细胞损伤的首要途径，我们将钙拮抗剂维拉帕米加入XJ-1液，在大鼠原位肝移植模型中，探讨维拉帕米的防护作用及其机制.   1 材料和方法   1.1 材料  健康雄性Wistar大鼠84只，体质量200300g，由北京市卫生部生物制品监督

9、局动物实验中心提供，随机分为3组:即XJ-1液保存组、XJ-1+维液保存组和未保存对照组，每组供、受体各14只，7只用来采取标本，7只用来观察移植术后生存状况及1wk存活率.根据经典的Kamada双袖套法并加以改进3 ，施行原位肝移植.液体配制用天平精确称取乳糖酸钠（若干）、棉子糖（若干）、组氨酸（若干）、磷酸二氢钾3.4g，还原型谷光甘肽0.9g，别嘌呤醇0.14g，硫酸镁1.23g，以双蒸水稀释至1000mL，配制成XJ-1液2 ;1000mL XJ-1液中加入维拉帕米注射液25mg，即配制成XJ-1+维液.以上液体均经1mol L-1 KOH调定pH值至7.4，2.5m孔径的滤膜抽滤除菌

10、，置于4冰箱保存，1wk内用完，其中肝素钠4000u在保存器官时临时加入.   1.2 方法  供肝切取时以4保存液10mL经腹主动脉灌洗肝脏，切取供肝后立即置入盛有04保存液30mL的小烧杯中行供肝修整，修整完毕加盖置入4冰箱保存18h再行肝脏移植，保存时间从切断供肝血供开始计算.检测:保存18h后肝组织含水质量分数:（湿质量-干质量）/湿质量×100%，保存液中LDH，AST，ALT等酶学指标的含量;术后4h重新开腹，从肝静脉抽血2mL，自动血液生化分析仪检测AST，ALT，ALB及胆红素，同时取肝组织标本;硝酸法测定肝组织中Ca2+ 含量，以g g

11、-1 （湿质量肝组织）表示.硫代巴比妥酸法（TBA）测定肝组织氧自由基代谢产物丙二醛（MDA）含量，以nmol g-1 表示;光镜及电镜下观察肝脏组织病理学的改变;观察动物术后1wk存活率及一般生活状况.   统计学处理:数据资料以x ±s表示，用SPLM软件作方差分析及均数检验，P0.05为有统计学显着差异. 2 结果   2.1 保存18h后肝组织含水质量分数  正常鼠肝含水质量分数（66.6±0.7）%，XJ-1液与XJ-1+维液保存18h后的肝组织含水（64.7±0.4）%，（65.2±0.9）%

12、，均低于正常（P0.01），但二者之间无差别（P0.05）;各组保存液保存鼠肝18h后，均可检测出ALT等酶学指标，但二者之间各项酶学指标的差异均无统计学意义（P0.05）.   2.2 再灌注后肝功能指标的变化  肝脏保存18h移植后4h，ALT，AST血清水平明显增高，肝组织损伤加重.其中，XJ-1+维液组血清ALT，AST明显低于XJ-1液组（P0.05），各组血清Alb水平无显着差异，胆红素水平普遍偏高，但无明显规律（Tab1）.表1 移植术后4h肝功能指标（略）2.3 肝脏组织中Ca2+ 质量分数  单纯保存的肝脏Ca2+ 质量分数显着低于移植

13、术后的肝脏（P0.01）;而术后XJ-1+维液组Ca2+ 质量分数明显低于不含钙拮抗剂的XJ-1液组（P0.01，Tab2）.表2 单纯保存及移植术后肝组织Ca2+ 质量分数（路）      2.4 肝脏组织中丙二醛含量（nmol g-1 ）  再灌注后（术后4h）XJ-1+维液组MDA含量（183±16）显着低于XJ-1液组（220±20）（P0.05），各组MDA含量均明显高于对照组（128±15）（P0.05）.        

14、   2.5 肝脏组织病理学改变  单纯保存的肝脏光镜下与保存前比较变化不明显，术后4h，光镜下见XJ-1液组肝小叶结构基本完整，肝板排列有些紊乱，可见脱落的内皮细胞，伴有肝细胞点状坏死，XJ-1+维液组改变比XJ-1液组轻，肝小叶结构尚完整，肝板排列比较整齐，偶见内皮细胞脱落，肝细胞变性坏死少见.电镜水平，术后4h肝脏细胞超微结构的损伤较单纯保存的肝脏严重，XJ-1液组胞质疏松，有较多空泡形成，线粒体肿胀明显，少数呈气球样变，内质网结构轻度改变，核糖体及糖原颗粒减少，胞核结构尚完整，部分内皮细胞变圆脱落，XJ-1+维液组见少量空泡形成，内质网结构正常，线粒体轻度

15、肿胀，偶见气球样变，胞核形态结构亦基本正常，少数内皮细胞变圆脱落.对照组肝脏病理学改变较二者轻.   2.6 移植术后存活状况及1wk存活率  各组动物手术均是同一作者完成，手术操作及各组间供、受体手术、无肝期时间均无差异，术后长期存活的动物，多在术后第2日恢复至术前状态，而短期内死亡的动物，早期恢复尚好，频死前出现眼结膜及消化道出血、摄食减少、毛发蓬松、活动减少，失去警觉性.对照组术后1wk存活率达100%，XJ-1液组1wk存活率为57%（4/7），1只于术后1d死于腹腔出血，另2只于术后2d死于肝功衰竭;XJ-1+维液组1wk存活率为71%（5/7），2只分

16、别于术后2和3d死于腹腔出血和肝功衰竭（Fig1）.3 讨论   安全有效的器官保存是移植成功的先决条件.理想的器官保存液应能有效地防止低温所致的细胞水肿，灌洗时组织间隙扩张，保存过程中细胞内酸中毒，及再灌注时氧自由基损伤，并能提供合成高能磷酸键所需的底物，Belzer等根据上述原则，结合器官间糖代谢差异的理论，创制了UW液.Jamieson等4 采用UW液首次保存犬肝48h后移植获得成功，随后UW液成功地用于临床肝、胰、肾等多脏器保存.肝移植的飞速发展，很大程度上要归功于UW液应用于临床.尽管如此，UW液仍有一些不足之处:高渗性引起细胞皱缩，高粘滞性影响原位灌洗，含高钾不

17、符合生理，缓冲体系的缓冲能力较低等，国内外有许多学者对UW液的保存机制及成分作用进行探讨，试图配制出更为有效的保存液，取得了一些成绩.我们曾研制出一种新的细胞外液型保存液XJ-1液，缓冲能力强，粘滞度低，成分简单，价格低廉，不含胶体和钙拮抗剂.研究发现XJ-1液对大鼠离体心脏的保存效果明显优于UW液，而在保存大鼠肝脏方面稍逊于UW液2 .   维拉帕米是电压依赖性钙通道阻滞剂，在心、肾、肝等脏器各种缺血模型中都曾被用来有效地防止缺血损伤，促进器官功能恢复5 .但这些结果仅是利用肝脏体外灌注模型得到的，并没有做肝脏移植术，观察动物的存活率.本实验中，我们将维拉帕米加入XJ-1

18、液，建立了稳定的大鼠肝脏原位移植模型3 ，发现XJ-1+维液保存18h的大鼠肝脏移植后4h，血清ALT，AST水平明显低于XJ-1液组（P0.05），肝组织钙离子含量较XJ-1液组低（P0.05），使其维持在   正常水平，同时反应氧自由基损伤的脂质过氧化代谢 产物MDA含量也显着低于XJ-1液组（P0.05），说明维拉帕米可以显着减轻肝细胞内钙超载，减少氧自由基损伤;在光镜与电镜水平也可观察到XJ-1+维液保存的肝脏优于XJ-1液，XJ-1+维液组肝移植1wk存活率为71%（5/7），高于XJ-1液组（57%，4/7），所以XJ-1+维液对大鼠肝脏的保存效果明显优于XJ-

19、1液.   细胞内钙超载是肝移植体保存再灌注损伤的关键机制之一.肝脏离体保存时，由于缺血乏氧，ATP生成减少，膜电位降低，Na+ -K+ 泵及Ca2+ 泵失活，膜通透性增高，Ca2+ 进入细胞;胞内钙库内质网、线粒体膜上的钙泵亦失活，也会释放大量Ca2+ 进入胞质;而乏氧代谢致酸中毒，胞质内蛋白结合钙以游离Ca2+ 的形式释放出来;再灌注时自由基大量产生，由于其脂质过氧化作用，进一步增加膜的通透性，导致Ca2+ 在胞质内进一步积聚6 .本实验中各组保存液均不含有钙离子，经保存液灌洗后的肝脏其脉管系统中钙离子所剩无几，细胞外、组织间隙中未被灌洗液冲出的钙离子内流是缺血保存期间

20、细胞内钙超载的一个来源，实验中还发现单纯保存的肝脏Ca2+ 含量显着低于移植后4h的肝脏，可见再灌注后氧自由基大量生成，进一步损伤胞膜结构，使得血液中的钙离子顺电化学梯度大量内流，胞内钙进一步超载，引起一系列病理生理变化，加重肝组织损伤.   维拉帕米由于其脂溶性而易于进入细胞，不仅在细胞膜上发挥其钙拮抗作用，阻止细胞外、组织间隙的钙离子内流，更为重要的是改善线粒体、内质网等细胞器对缺血乏氧的不良反应，防止细胞内有害的钙离子分配，再灌注期间，进入细胞内的维拉帕米仍可发挥其钙通道阻滞作用，阻滞血液中的钙离子内流入细胞使其免于进一步的钙超载，从而维护细胞的结构与功能，减少保存再

21、灌注损伤.实验中发现XJ-1+维液组的供肝移植恢复血流后，表面呈鲜红色，无花斑状表现，门脉不扩张，肝脏无肿胀，肠管无淤血，各种表现均优于XJ-1液，可见维拉帕米可扩张血管系统，改善微循环，减轻再灌注损伤.   实验结果表明XJ-1液中加入维拉帕米，明显提高了对大鼠肝脏的保存质量，也显示了钙拮抗剂对于大鼠肝脏保存的重要性，为寻求配制更为简单高效的器官保存液奠定了基础. 参考文献:   1De-Broin E，Urata K，Giroux L，Lepage R，Huet PM.Effect of calcium antagonist on rat liver

22、 during extended cold preserva-tion-reperfusion J.Transplantation，1997;63（11）:1547-1554.2Guan WX，Li KZ.Manufacture of XJ-1organ preserve solution and experiment study of preventive effects of TLSFJM on liver and heart transplants with acute rejection in the rat D.Xian:Department of Hepato-Biliary Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，1999.   3Guan WX，Li KZ，Gao CJ，Wang TP，Wang DS.Perioperative treatment techniques in rat orthotopic liver transplantat