黄曲霉毒素检测方法及其应用

1、黄曲霉毒素检测方法及其应用            【关键词】  黄曲霉    自20世纪60年代初英国发现火鸡中的黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）中毒症以来，国内外学者对AFT进行了广泛的研究。研究证实，AFT是到目前为止所发现的毒性最强的真菌毒素。AFT的急性毒性是氰化钾的10倍，它不是单一的化合物，而是一大群结构十分相似的化合物，目前至少分离出17种化合物，与肝癌有关的黄曲霉毒素B 1 （AFB 1 ）是最常见的一

2、种。AFB 1 是剧毒物质，其致癌强度比奶油黄大900倍，比二甲基亚硝胺高75倍，可诱发所有动物发生肝癌 1 。由于AFT毒性大，污染广，且难以去毒，对人类健康危害极大，因此对AFT的监测显得十分重要。自1966年世界卫生组织、联合国粮农组织以及国际儿童基金会提出了食品中AFB 1 最高允许量标准以来，这一标准已修订数次，从30ng/g降至15ng/g。在我国，随着生活质量提高，无害食品的普及，为保障公众健康，AFBl允许量标准也将逐步降低。为适应国内外这种发展趋势，有利于提高对AFB 1 的监测水平，加强对AFB 1 污染的控制，近年来，国内外学者对AFT的检测研究一直不断进展，检测方法的灵

3、敏度不断提高，特异性得到增强，高效、简便、经济的特点为AFT检测及预防效果的评价开辟了新途径。 1 检测方法     AFT的测定方法有多种，概括起来有化学分析法、仪器分析法、生物鉴定法及免疫分析法等 2 。    1.1 生物鉴定法 其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，共有10种:（1）抑菌试验;（2）对微生物遗传因子影响试验;（3）细菌发光试验;（4）荧光反应;（5）组织培养检测法;（6）鸡胚试验;（7）鸭胚试验;（8）鳟鱼试验;（9）植物试验;（10）饲喂实验动物试验。生物鉴定法是利用AFT能影响微生物、水生动物、

4、家禽等生物体的细胞代谢，来鉴定AFT的存在。其方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证。    1.2 化学分析法 最常用的为薄层层析法（TLC），适用于粮食及其制品、调味品等AFB 1 的检测，主要是半定量。利用AFB 1 具有荧光性的特点，提取和浓缩样品中的AFB 1 ，用单向或双向展开法在薄层上分离后，在365nm紫外光照射下产生蓝紫色荧光，根据在薄层上显示荧光的最低检出量定量，其灵敏度为5g/kg。由于薄层层析法测定AFB 1 不是很专一，因此样品中其他荧光物质的干扰造成测定误差。可以用以下方法进行确定:一是用多种溶剂系统展开，可将AFB 1 、

5、G 1 及各种AFT类似物分开;二是采用层析斑点的化学试验，将样品提取物用甲酸亚硫酰氨或三氟醋酸处理，用衍生化的方法将AFB 1 与其类似物分开;三是层析斑点的物理试验，可根据紫外吸收光谱，红外吸收光谱和荧光屏光谱的差别，将非黄曲霉毒素和AFT分开。    1.3 仪器分析法 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种以液体为流行相的新型色谱技术。是分离分析各种AFT的好方法，如配以荧光检测器，则该法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠等优点。在国外己广泛地用于食品中AFT的测定。但由于食物样品成分复杂，在进行液相色谱分离分析前，

6、需对样品作彻底有效的净化处理。常用的净化方法是柱色谱法，该法操作繁琐，且需使用大量有机溶剂。免疫亲和柱作为AFT特异有效的分离净化和浓缩手段，一出现就和高效液相色谱法结合用来测定粮食、饮料、尿、血及奶中的AFT。王光建等 3 将免疫亲和柱的高度特异性和高效液相色谱法的高分离能力相结合，所建立的花生和玉米中AFB  l 、B 2 、G 1 、G 2 的测定方法，具有杂质干扰少、操作简便、使用有机溶剂少、灵敏准确等优点，整个分析操作可在15min内完成。    1.4 免疫分析法 这种方法是利用免疫、酶及生化技术，开辟了AFT分析的新领域。目前应用的方法有放

7、射免疫法、亲和层析法和酶联免疫法。（1）放射免疫法。特异性强、灵敏度高、比较准确迅速、操作简单、易于标准化。但也有严重的缺点，特别是需要持殊的设备和安全保护，妨碍了更广泛的应用。（2）亲和层析法。利用免疫化学反应原理，采用大剂量的单克隆抗体，选择性吸附提取液中的抗原物质-AFT。由于抗原-抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，十分有利于操作人员的健康和环境保护。张艺兵等 4 提出了一种以免疫亲和柱净化结合荧光光度法检测AFT的新方法，检测低限可达10 -11 10 -12 g/ml。20世纪90年代起，免疫亲和技

8、术在食品分析领域得到了广泛应用。（3）酶联免疫法（ELISA）。基本原理是将抗体吸附于固相载体上，加入已经用酶标记的抗原与样品中的待测物混合物进行特异性的免疫反应，然后再加入酶的底物进行显色反应，通过颜色的深淡来判断样品中待测物的（抗原）含量。酶联免疫法大体分为两类:是用双抗体夹心法检测样本中的AFT。如Wogan将AFB  l 牛血清白蛋白涂于微滴定板池，经初步培养后，加兔的APTB 1 抗体和游离APTB 1 用磷酸4硝基苯酯作基质。以碱性磷酸酶抗兔免疫球蛋白检测第抗体的结合;二是用竞争法检测样本中的AFT。如在涂抗体的小孔中，用乙烷萃取的AFB  l ，并与结合了辣根

9、过氧化酶的AFTB 1 混合室温下10min后，用水洗除去未结合的黄曲霉共轭物，加底物后在405nm检测。ELISA法灵敏度高，比薄层法提高了近200500倍 1，5 ，特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰。而且回收率高，准确性好，提取方法简单，测定时间仅需2h，可同时检测几十份样品，提高了工效。 2 比较与应用     2.1 关于酶联免疫法与薄层层析法的比较 AFT的检测有简易的方法，但不能定量;也有复杂的方法、可以定量，但不易推广。由于高效液相色谱法虽然具有快速、灵敏度高、准确、自动化等优点，但因仪器价格昂贵，难以在基层推广。故在此仅将

10、最常用的薄层层析法与酶联免疫法进行一下比较。    薄层层析（TLC）是最初被用于检测AFB 1 的标准分析方法，在酶联免疫吸附法建立之前，国家标准一直采用薄层层析法作为测定AFB 1 的基本方法。TLC测定AFB 1 ，其步骤多，耗费大量试剂，干扰因素多，测定一个样品要23天时间，灵敏度低，荧光强度的目测精确性较差，仅能半定量且操作人员要直接接触毒素和接触大量有潜在危害的有机溶剂，不适于大批量样品的快速检测。从几十年的实践中总结得出这种方法的主要不足之处是灵敏度不高，特异性不强和安全性能较差。    ELISA法是近年快速发展起来的

11、一项实用新技术，它利用抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化作用进行定性定量测定，其特异性强，灵敏度高，分析速度快，并可简化提取和纯化等步骤，在微量毒害物质的检测中已得到广泛应用。由于ELISA法中酶的活性较敏感，某些特殊样品，如葡萄酒类、含盐量高的酱油、含脂量高的食用油等，在提取时要进行调pH值、脱盐、脱脂处理，以免对酶活的影响，提高测定的准确性。    酶联免疫法对AFB 1 的最低检出浓度为0.01g/kg，比薄层分析法检测灵敏度高500倍，而且，由于单克隆抗体本身具备的强特异性，定量分析和定性分析等于同时完成，所对呈阳性结果的样品不必再做确证试验，检测结果准确

12、稳定。其它荧光物质、色素、结构类似物对检测无干扰，整个测定过程仅需2h，并且一次可同时测定几十份样品。在样品提取时，也因此适当简化了反复纯化、分离的步骤，适合处理批量样品。此外，用酶免疫法检测法时，使用者对照标准抑制曲线用数值插入法计算结果，可以避免因接触标准毒品受到的伤害。ELISA测定AFB  l 已于1989年首先在美国公职分析家协会获得通过，被列为国际上公认分析方法。2.2 AFT检测的应用研究 （1）在食品卫生检验中的应用。国内在20世纪90年代中期也开展了ELISA检测AFB 1 的应用研究 68 ，取得了很好的效果，显示出了方法简便易行，耗时少，特异性强，灵敏度高的特点

13、，对于大量样品的筛选检测尤为适合。路戈等 7 用单克隆抗体酶联免疫测定方法与薄层层析法对比检测了粮油样品，TLC法检测结果表明，在方法灵敏度下（5ng/g）所检样本中均无AFB 1 检出。而这些样品按ELISA法检测，AFB  l 检出率为96%，含量在0.052.20ng/g之间。ELISA法的检测灵敏度远高于TLC法。陈兰明等 8 认为AFB  l间接竞争抑制ELISA（IDCELISA）定量分析法传统TLC法更具有简便、经济的特点，它不仅适用于大批量样品的快速检测，而且具有投入商品化生产及“家用化验”发展的潜力。刘冬儿 9 用酶联免疫吸附分析法测定食品中的AFB

14、60; l ，线性范围0.255.0ng/ml，检测灵敏度达0.015g/kg，比薄层色谱法提高300400倍，回收率大于89.2，精密度大于7.67%。整个测定过程仅为4h，大大缩短了检测时间。笔者 10 也曾采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测启东地区106例玉米样品中的AFT含量，并 与常规薄层层析法进行了比较，结果证明ELISA法优于薄层层析法。ELISA法检测的含量均高于薄层层析法，且未出现假阴性现象，显示ELISA法具有特异性和高灵敏性。该法为食品卫生检验、为肝癌高发现场粮食中AFT的监测及防霉去毒研究等提供了一个良好的技术手段，具有较好的应用前景。（2）在肝癌病因与预防中的应用

15、。迄今为止，AFT的致肝癌性在动物实验研究中已没有人怀疑。但在人类中的研究由于缺乏直接的证据而尚不能充分肯定，不过人类食物中AFT的普遍污染是人肝癌发生的可能因素的观点已得到了广泛的承认。目前认为测定AFT白蛋白（AF-Alb）化合物可以作为摄入AFT的体内指标;并经全球众多的研究证实AF-Alb是一个用于估计AFT暴露水平很好的标记 11 。    AFT暴露的生物标记是基于对人类中这些化合物的了解而建立起来的。生物标记水平的改变可用来评价干预的有效性。例如，旨在降低AFT摄入的一级预防干预措施应当能够导致所有生物标记水平的下降。此外，检测个体AFT代谢情况的能力意味着，还能评价设计用来改变AFT代谢的化学预防剂的有效性。Qian等 12 在上海、Kensler等 13 在启东、Wang等 14 在扶绥进行的多项关于肝癌化学预防的实验，也均借助于免疫吸附柱纯化等AFT检测技术，并应用于受试者尿样或血样的分析，来评价预防干预的效果。      参考文献14 Wang JS，Huang T，Su J，et al.Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zh