安捷伦HPLC1260自定SOP.

1、1. 目的此SOP为Agilent 1260（Chemstation）高效液相色谱仪的操作、维护、维修及校准提供指导。2. 范围此SOP适用于仪器管理员和实验人员对Agilent 1260（Chemstation）高效液相色谱仪的操作、维护、维修及校准。3. 定义无4. 职责4.1 仪器管理员4.1.1 负责对实验人员进行培训。4.1.2 负责确保实验人员遵循此SOP中的规定。4.1.3 负责对仪器的维修及校准。4.1.4 登记仪器的故障检查及处理情况。4.2 实验人员4.2.1 按照此SOP中描述的程序进行操作和维护。4.2.2 登记仪器使用情况和日常维护情况。4.2.3 液相色谱仪或程序发

2、生故障时需立即通知仪器管理员。5. 程序5.1 操作步骤5.1.1 查看仪器的校验标志，未经校验的仪器不得使用。5.1.2 检查仪器使用记录登记，了解前一次仪器使用情况及仪器完好情况。5.1.3 开机5.1.3.1 准备好流动相5.1.3.2 打开计算机电源，输入用户名和密码，进入Windows 2007画面。5.1.3.3 打开1260 HPLC各模块电源。双击桌面上“HPLC 1260（联机）”图标，出现登录画面，在“登录名”中输入用户名，“密码”中输入密码，点击“确定”。工作站自动与1260 HPLC通讯，进入联机工作站画面。切换至“方法和运行控制”界面。本仪器有两名管理员，用气用户名和

3、密码进入系统可增加用户，设定权限。可有多名实验人员，实验人员可进行方法、序列和报告的创建和修改。5.1.4 更换色谱柱安装色谱柱，确保管路管口顶住柱芯，旋紧螺帽。确保色谱柱的方向正确。5.1.5 排气5.1.5.1 把流动相放入溶剂瓶中。5.1.5.2 检查泵密封垫清洗溶剂瓶中的15%异丙醇是否足量，是否干净。在泵运行前，右键点击系统视图中的四元泵模块，选择“控制”，泵密封垫清洗组件下勾选“定期”，设置“周期”和“开启时间”，点击确定。5.1.5.3 打开排气阀，为各个泵排气，设置泵的参数，右键点击四元泵模块，勾选溶剂A，设定比例为100%，流量设为5.0 mL/min，运行2分钟后，依次用同

4、样的方法设置溶剂B、溶剂C、溶剂D。4个泵排气完成后，每个泵比例设为25%，流量为5.0 mL/min，混合脱气2分钟，待排气完成后停泵，关闭排气阀。5.1.6 方法，序列及数据路径及文件名的设置。5.1.6.1 进入脱机工作站：双击桌面上“HPLC 1260（脱机）”图标，进入脱机工作站画面。5.1.6.2 方法：文件夹图标“调用方法”选择“仪器名方法”文件夹新建文件夹“项目名”在“项目名”下新建“项目”最后一个文件夹中以当日的日期为文件名。5.1.6.3 序列：文件夹图标“调用序列模板”选择“仪器名序列”文件夹新建文件夹“项目名”在“项目名”下新建“项目”保存序列时以最后一个文件夹中以当日

5、的日期为文件名。5.1.6.4 数据：文件夹图标“调用数据”选择“仪器名数据”文件夹新建文件夹“项目名”在“项目名”下新建“项目”在“项目”文件夹下新建当日检测文件夹在其中新建“日期”文件夹，序列数据名保存为“001，002，.”。（仪器数据存储路径暂时无法更改）5.1.7 新建及调用方法5.1.7.1 新建方法5.1.7.1.1在联机工作站画面，切换至“方法和运行控制”界面。选择“方法”菜单下的“新建方法”，调用化学工作站的缺省方法DEF.LC.M。5.1.7.2 设置仪器参数5.1.7.1.2.1 设置进样器：右键点击进样器模块，选择“方法”。在弹出的界面下进行如下设置：设置进样量；“针清

6、洗”项下勾选“启用洗针”并设置洗针瓶位置；“停止时间”项下点选“与泵一致/无限制”；其他选项一般采用默认设置。5.1.7.1.2.2 设置四元泵：右键点击四元泵模块，选择“方法”。在弹出的界面下进行如下设置：设置流量；“溶剂”项下勾选所用溶剂，并设置溶剂百分比和名称；“停止时间”项下设置采集时间；“后运行时间”是一次运行结束后，到第二次进样前的等候时间，做梯度洗脱时，一定要设置该数值，等待系统中的流动相真正变成下一次进样的初始比例；在“时间表”处设置梯度洗脱程序，规定溶剂比例变化方式，要注意程序时间与“停止时间”和“后运行时间”之间的协调关系；其他选项一般采用默认设置。5.1.7.1.2.3

7、设置柱温箱：右键点击TCC模块，选择“方法”。在弹出的界面下进行如下设置：在“温度”项下选择柱温箱左侧及右侧控温模块的控温模式，设置温度；“停止时间”项下点选“与泵一致/无限制”；其他选项一般采用默认设置。5.1.7.1.2.4 设置DAD检测器：右键点击DAD模块，选择“方法”。在弹出的界面下进行如下设置：在“信号”项下勾选需要采集的通道，设置波长、带宽、参比波长和参比带宽，波长一般选择化合物吸收光谱的最大吸收波长处，且大于溶剂的截止波长20 nm以上，参比波长设在样品没有吸收处，另外要求参比带宽带宽（样品）狭缝；“光谱”项下选择采集吸收光谱时的参数，存储一般选择“全部”，其他采用默认设置；

8、“停止时间”项下点选“与泵一致/无限制”；“采集期间需要开启灯”项下点选“UV灯”，如果当前所编辑的方法为冲洗色谱柱的方法或使用RID检测器的方法，建议取消“UV灯”； 其他选项一般采用默认设置。5.1.7.1.2.5 设置RID检测器：右键点击RID模块，选择“方法”。在弹出的界面下进行如下设置：“光学设备温度”项下设置检测器温度；“信号极性”设置色谱峰的正负极性，一般点选“正（+）”；“停止时间”项下点选“与泵一致/无限制”；“后运行时间”项下一般点选“关闭”；“分析前自动归零”点选“开启”；“分析后自动循环”用以选择运行结束之后溶剂是否自动循环回收，一般选择“打开”；“自动清洗”项下一般

9、不勾选，因为使用RID时一般不使用变化的流动相组分；其他选项一般采用默认设置。5.1.7.1.3 保存方法：从“方法”菜单选择“保存方法”或“方法另存为”保存方法。5.1.7.3 调用方法调用已设置好的方法：选择“方法”菜单下的“调用方法”，选择相应方法文件，如需修改按照5.1.7.1进行。5.1.8 新建及调用序列5.1.8.1 新建序列5.1.8.1.1在联机工作站画面，切换至“方法和运行控制”界面。选择“序列”菜单下的“新建序列模板”，调用化学工作站的缺省序列模板DEF.LC.S。5.1.8.1.2 命名“首选项”中的序列数据文件夹：从“视图”菜单下选择“首选项”，在“序列”选项卡下的“

10、数据存储”部分选择“专有文件夹创建启用”功能；可在“命名模式”部分规定运行序列所得到的序列数据文件夹的名称。5.1.8.1.3 编辑“序列参数”和“序列输出”：从“序列”菜单下选择“序列参数”，在“序列参数”选项卡下指定数据文件的存储路径，规定数据文件的命名方式；在“序列输出”选项卡下指定序列总结报告的输出方式和模板。5.1.8.1.4 编辑“序列表”：从“序列”菜单下选择“序列表”或点击系统视图中部的样品小瓶图标进入序列表编辑界面。在“样品位置”列输入样品瓶号；“样品名称”列输入样品名称；“方法名称”列点击序列表上方“浏览方法”调用编辑好的方法；“进样量”列输入进样体积；“进样次数”列输入进

11、样次数；“样品类型”列选择样品的类型，包括样品（普通样品）、标准样品、质控样品和空白；其他列一般不用填。5.1.8.1.5 保存序列：从“序列”菜单选择“保存序列模板”或“序列模板另存为”保存序列模板。5.1.8.2 调用序列调用已设置好的序列：选择“序列”菜单下的“调用序列模板”，选择相应的序列文件，如需修改按照5.1.8.1进行。5.1.9 样品测定5.1.9.1 单个样品测定：点击菜单栏下方的单个样品瓶图标，“选择运行方法任务”，点击系统视图的“单次样品”，开始单次样品运行，在四元泵模块设置停止时间或点击系统视图的“停止”，停止单次运行。5.1.9.2 序列测定：从“运行控制”菜单选择“

12、运行序列”或点击菜单栏下方的多个样品瓶图标，“选择序列任务”，点击系统视图中部的样品小瓶图标进入序列表界面，点击右下方“运行”，开始运行序列。5.1.10 数据处理5.1.10.1 双击桌面上“HPLC 1260（脱机）”图标，出现登录画面，在“登录名”中输入用户名，“密码”中输入密码，点击“确定”。工作站自动与1260 HPLC通讯，进入脱机工作站画面。切换至“数据处理”界面。5.1.10.2 调用数据文件：从“文件”菜单下选择“调用信号”，选择所需数据文件。可以从“文件信息”中查看数据的信息。也可以在调用数据的窗口中指定调用哪一张色谱图。点击“文件”菜单下的“重叠信号”可以在同一个窗口中叠

13、加调用色谱图。5.1.10.3 按要求设置合适的积分事件，保存方法。积分事件将被应用于序列所有数据。5.1.10.4 如果自动积分和利用积分时间表设置积分参数都不能满足对积分的具体要求，使用手动积分工具栏进行积分条件优化。5.1.11 分析报告的打印5.1.11.1 数据结果的打印：数据按5.1.10处理完成后，从“报告”菜单选择“设定报告”进入报告参数设置窗口，按要求设置合适的报告参数，从“报告”菜单选择“查看报告文件”或“打印报告”预览报告或打印报告。5.1.11.2 序列总结报告的打印：所有序列数据按5.1.10处理完成后，从“序列”菜单选择“序列参数”，在“序列输出”选项卡下按要求设置

14、合适的报告参数，勾选“序列结束后预览”，点击工具栏的“开始序列重处理”图标，在重处理结束后生成序列总结报告，打印。5.1.12 关机5.1.12.1 样品测定完成后，先关DAD的UV灯，用相应的溶剂充分冲洗系统和色谱柱。5.1.12.2 关泵后退出化学工作站，关闭计算机。5.1.12.3 关闭Agilent 1260各模块电源开关。5.1.13 注意事项5.1.13.1 已有方法或队列文件打开时，新建或打开其他的方法或队列文件时，有时会出 现提示信息提示当前的文件被改变，询问是否保存，依需要决定。5.1.13.2 本规程适用于供试品的常规测定，其他方面，则需参考仪器使用说明书按照具 体情况设定

15、操作方法进行测定。5.2 仪器的日常维护及维修5.2.1 仪器的日常维护5.2.1.1 当仪器任何一个模块出现错误信息时，该模块红色提示灯会亮起，同时在工作中系统视图log中会记载错误信息的具体内容，可以根据提示进行排查故障。5.2.1.2 在使用仪器之前在日常使用之前，必须确定仪器已经处于冲洗完毕的状态， 如果上一个人未能及时冲洗仪器，可以进行自行的冲洗过程，即：将仪器的 所有通道在过渡性试剂（5%甲醇）及纯的有机相中进行冲洗，每次时间不得 低于30 min。5.2.1.3 所用的冲洗试剂及流动相必须为未过期的过滤过的溶剂，各流动相有效期：纯有机相3个月，纯水2天，缓冲盐类2周，有机相加水相

16、1个月。5.2.1.4 泵头清洗液（15%异丙醇）为一次性试剂，不可以反复使用，并且需要处于 长流动状态。5.2.1.5 当试验过程需要更换不同流动相时，必须将仪器的整个管路在过渡媒介中进 行过渡，一般是能够洗脱掉上个流动相所引进的杂质的稀释剂，过渡时间不 得少于20 min。5.2.1.6 在试验结束后，必须将色谱柱连接仪器一同冲洗，如果没有特殊说明，冲洗的顺序为 10%甲醇100%甲醇，每次冲洗时间不得少于30 min，最终使仪器体系处于纯的有机相中，防止体系内部滋生细菌。5.2.1.7 仪器的清洁：如果仪器外表面有污垢，使用软的干布擦干净；如果表面很脏，请按下述方法清洗：用布沾稀释的中性

17、洗涤剂，拧干后，擦净脏处，用另一块布沾清水，拧干后，擦去所有洗涤剂的痕迹，然后用干布擦干。 清洗后务必擦干表面，标签不能使用醇或稀溶剂清洗，否则会引起生锈或退 色。5.2.2 仪器的故障检查及处理方法5.2.2.1 当排气时压力过大时(以纯水为流动相，5.0 mL/min，排气时，压力高于 5 bar)， 更换过滤白头。5.2.2.2 运行时系统压力过大，检查检测器出口端是否堵塞，色谱柱是否完好可用，导 致的系统压力过高，按照此步骤进行逐一排查。5.2.2.3 运行时压力波动过大，检查流动相过滤器是否堵塞或是排气阀没有拧紧，导致 气体进入管路造成波动，排出管路内的气体即可，如果排出气泡后仍然没

18、有改 善，使用异丙醇进行冲洗仪器，将仪器管路内的杂质冲出，并保证没有气流直 吹检测器，阳光没有直接照射检测器。5.2.2.4 氘灯能量的检查，每三个月进行一次氘灯能量检查，使系统内充满纯化水，运 行Agilent Lab Advisor软件进行诊断，此项工作由仪器设备管理员定期进行检查。5.2.2.5 仪器管路的系统冲洗：在仪器应用频繁的情况下，每月需要进行一次仪器管路的系统冲洗，具体步骤 如下：仪器连接两通后，所用试剂的顺序为热水稀硝酸纯化水水-甲醇（1:1） 甲醇，每种试剂排气30 min，冲洗30 min。5.2.2.6 附表二：特殊维护登记表 每日进行的日常维护和必要时进行的故障检查及

19、处理方法均需要进行记录，记录要求参照5.4仪器的使用登记，日常维护由仪器的每日操作者进行，故障检查及 处理方法由仪器管理员进行。5.3 使用注意事项5.3.1 流动相的选择：采用“HPLC”级溶剂；避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂；流动相对试样有适宜的溶解度；溶剂粘度要小；所用流动相要与检测器相匹配。5.3.2 溶剂等级：溶剂都经过0.45 m滤膜过滤，除去纤维毛、未溶解的机械颗粒；优级纯的纯度比分析纯大，单里面含有防腐剂和抗氧化剂，有一定吸收；缓冲液使用前必须经0.45 m滤膜过滤，使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞，使用后不能直接用有机溶剂冲洗，要用10%甲醇冲洗30

20、 min，再用甲醇冲洗30 min。5.3.3 溶剂前处理：过滤：经0.45 m或更小孔径滤膜过滤，除去溶剂中的细小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时；脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。5.3.4 样品处理：尽量使用流动相溶解样品，减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要，保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀；进样前最好使用0.45 m的膜进行过滤，如果样品很脏，要使用0.2 m的膜进行过滤。5.3.5 色谱柱使用注意事项5.3.5.1 柱温一般不超过50。5.3.5.2 流动相pH范围2至7.5。5.3.5.3 当流动相中有机溶剂比例

21、过低时，柱效下降快。5.3.5.4 注意保护色谱柱：过滤所有的溶剂和样品；仪器在使用完毕后，要冲洗整个系 统，移走系统中缓冲液；色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙腈/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）；注意色谱柱 的pH值使用范围；不要高压冲洗柱子；不要高温下过长时间使用硅胶键合相。5.3.5.5 在使用新柱子前，最好用强溶剂在低流量下（0.20.3 mL/min）冲洗30 min，长时间未用的分析柱也要同样处理。5.3.5.6 定期使用强溶剂冲洗柱子。5.3.5.7 使用缓冲盐时，要先用甲醇水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。5.3.5.8 不使用时，要拧紧盖子，同

22、时用封口膜封严，避免固定相干枯。5.3.6 根据需要设定参数。由于每根色谱柱性能，填料各不相同，要依据其特性设定 最高保护压力，防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。5.3.7 检测器的光源具有一定的使用时间，所以每次在进样前半小时左右打开，实验 结束后，应先关闭检测器电源，但不可以频繁开关光源。5.3.8 最后根据色谱柱的填料不同，采用不同的溶剂，保存色谱柱。以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱宜用甲醇再生，保存；以硅胶为填料的色谱柱宜保存在正己烷-乙腈（99：1）中，防止长时间存放色谱柱发霉。5.3.9 操作者应细心，了解仪器各部件性能。5.3.10 每次操作完毕后，应及时清理所用物品，倒掉废瓶中的废液，用柔软的抹布擦 拭仪器表面，保持仪器的清洁。5.3.11 若仪器长时间不用，可定期加电，使仪器预热一段时间，以免仪器内部件受潮。5.3.12 砂滤头不能超声清洗，用35%的硝酸泡12小时，用纯化水冲洗干净。5.3.13 及时更换排气阀内的过滤芯。（当打开排气阀时，在流动相为纯水时，使用5 mL/min流速，压力高于5 bar，表明过滤芯已堵）。5.3.14 流动相使用前必须脱气，脱气的目的是排除溶解在水中的氧气和氮气。5.3.15 Agilent 1260液相为四元泵低压液相，A、D泵在下方，B、C泵在上方，当用