工作原理及使用说明

1、Thermo Accela UPLC 工作原理及使用说明 仪器特点型 号：Accela 制造厂商：Thermo，美国主要技术指标：流速范围：0.0011ml/min、压力：操作压力为015000bar 检测器:二极管阵列检测器、 波长范围:190800nm高效液相色谱的基本原理：PUMPDetectorWData station (Recorder) or Collection 液相色谱工作流程图由流程图可以看出系统由流动相、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内。由于样品溶液中的各组分在色谱柱中的

2、淋洗液和固定相间两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。高效液相色谱仪的应用高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂体系中的微量成分。UPLC应用特点： U

3、PLC（ultra performance liquid chromatography）,除了具备和常规HPLC类似的分析特点外，由于可承受高压力，可使用细粒径液相色谱柱，因此在分离度和分离速度上具有较大优势，同时可以减少溶剂的使用量。但因此也对溶剂及样品预处理及仪器的使用和维护有更高的要求。操作规程一、 准备工作1查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液相色谱分离条件。2检查线路是否连接完好。检查流动相、洗针液是否充足，不足则根据要求添加。 3有机流动相必须为进口HPLC级，水相可使用Millipore纯水机出水或娃哈哈屈臣氏纯净水。所有流动相在使用前均需用0.2m的滤膜过滤（水和缓冲液用水

4、相滤膜,有机相用有机相滤膜），其中水相需每天更换以保持新鲜。4标样和样品在使用前必须用0.2m的针头式滤器（进口非分装）过滤。5将样品放置在样品托盘上，并记录相应的位置。且第一个和最后一个样品为不含营养盐的流动相，用于清洗进样系统及管路。二、 开机1打开稳压电源（指针指示220V），打开仪器面板Accela AS、Accela PDA、Accela Pump电源开关。2打开电脑，双击工作软件Xcalibur，在status状态栏下看到AS、PDA、Pump三项显示ready to download；仪器面板灯除Pump部分的RUN灯呈橙色外，其余灯均为绿色，表明仪器及通讯正常，可进行下一步操作

5、。3 purge管路系统，直至无气泡。方法如下：打开Accela Pump左侧的门，将塑料针筒接到purge阀的输出管上，逆时针拧松purge阀；将Accela pump中的purge阀拧到左边；点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela Pump，点击下拉主菜单中Accela Pump栏中的direct control跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入flow为200l/min，选择相应的流动相（设为100%），点击play键开始purge，10min左

6、右可按停止键；同样的方法可purge其它流动相通道。Purge完后将purge阀顺时针拧到右边，取下针筒中的废液倒入指定的废液桶。4检查Accela AS门上自动进样针筒上部黄色密封圈上端是否有气泡，如有气泡则要先行排气，方法如下：点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela As，点击下拉主菜单中Accela As栏中的direct control跳出该界面；选择Flush syringe，点击apply（注意此时要关上AS的门）；连续数次赶尽气泡。5 稳定泵系统。双击软件Roadmap中Inst

7、rument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela Pump，点击下拉主菜单中Accela Pump栏中的direct control跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入所需流动相启动泵系统，运行20min后方可进行其它操作（如运行sequence）。三、创建分析方法1建立method打开UPLC工作站Xcalibur，双击Roadmap界面中的Instrument Setup图标，点击Accela AS、Accela PDA、Accela Pump图标分别设置参数。Accela AS参数设置：除In

8、jection volume（可设为1-20l）外，其余参数请不要更改。Accela PDA参数设置：根据样品实际情况对run lengthtime、spectra、channels等进行设置。Accela Pump参数设置：选择Gradient Program界面，编辑流动相梯度（注意正确选择通道，以免气泡进入系统）参数设置完后保存方法（默认路径为：d:UPLCmethod）。2建立sequence点击sequence view图标进入sequence编辑界面。对于已建分析方法的样品，可直接在原来的sequence内添加样品信息。新建sequence，样品类型选择Unknown，双击Inst

9、 Meth和ProcMethod（如没有工作曲线时可先不填此项）输入方法名及定量分析方法，输入分析样品在Accela As中的位置以及进样量，以此类推编辑整个序列，遍及完后保存序列，并点击按钮 运行四、样品分析1点击按钮real time plot play可以看到实时采集的数据。开启仪器半小时左右，可观察到仪器信号基线平稳。2sequence设置完毕后，点击run sequence进行样品分析（注意选择所需分析样品的序列号）。3在做标样时，标样也先作为未知样品分析，待所有样品分析完后再进行定量分析。五、分析结束1进样系统清洗：以不含营养盐的流动相为样品（最后一个样品）run2-3次，清洗进样

10、系统。2管路及柱系统清洗（重要）：用一定比例的有机相和纯水（不含缓冲盐以及甲酸、乙酸、醋酸铵等其它添加物）流动相洗柱, 至无明显出峰为止。最后用80%以上的有机溶剂保存柱子。3关闭工作站窗口，退出工作站；关闭仪器面板Accela AS、Accela PDA、Accela Pump电源开关；关闭电脑，关闭稳压电源。4取出样品瓶，清洁桌面，在仪器使用记录本上登记。六、数据处理1定量分析过程（建立工作曲线）参考“Xcalibur 定量分析”说明书。2未知样品结果分析，打开sequence在Pro Meth中输入定量分析方法。选择需计算浓度的样品，点击Batch Reprocess Setup，选择Q

11、uan栏，Peakdetection&Intergration以及Quantitation（注意其余选项不要打勾），点击OK。3点击Roadmap进入Quan Browser，打开sequence文件名，选择显示所有数据，点击unknows查看样品结果。注意事项：1每次开机都先purge流动相管路及自动进样机械手以防止起泡进入系统。2. 安装色谱柱时注意流动相的方向，开机前注意流动相瓶内是否有足够流动相、洗针液瓶内是否有足够洗针液，自动进样器syringe内是否有气泡。3所有需戴手套进行的操作（包括样品预处理及流动相过滤等），必须使用无尘手套（其它手套中的粉末会堵塞管路及色谱柱，造成严

12、重损失）。4拭擦仪器管路及其它部件时必须使用无尘纸。5样品瓶盖尽量不要多次使用，以免密封垫片的碎屑堵塞进样针及UPLC系统。6. 实际样品必须事先用0.2um的滤膜过滤才可使用。7.使用过程中注意观察系统压力，压力升高时考虑清洗柱前滤芯。8氘灯使用寿命有限，仅进行数据分析时，可以关闭UPLC仪器上的三个电源按钮，或点击软件双击Roadmap中Instrument Setup图标，显示Instrument Setup界面，点击左侧仪器图标中的Accela PDA，点击下拉主菜单中Accela PDA栏中的direct control，选择configure界面，将相应的光源turn off，但频繁开关也会缩短灯寿命