实验方案设计

1、精品实验方案设计1. 仪器设备：超净工作台,超声波清洗器,漩涡振荡器,CP224S 电子秤量仪,隔水式恒温箱 ,Q/CYAB10-2001 手提式压力蒸汽灭菌锅 ,电冰箱 ,蒸汽消毒器 ,PH 计 :PH_3C, 培养皿 ,试管 , 牛津杯，电炉等 试管 ,三角烧瓶 ,烧杯 ,量筒 ,玻璃棒 ,培养基分装器 ,扭力天平 ,牛角匙 ,高压蒸汽灭菌锅 ,pH 试纸 （pH5 5 9 0 ） ,棉花 ,牛皮纸 ,记号笔 ,麻绳 ,纱布等。2. 实验方案3.1培养基的制备MRS 培养基液体培养基： 蛋白胨 10g, 牛肉膏 10g, 酵母膏 5g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠 5g,磷酸氢二钾2g, 硫

2、酸镁 .7H 2 O0.58g, 硫酸锰0.25g, 吐温 -801ml, 蒸馏水1000ml, P H6.2-6.4.,琼脂 18g, 葡萄糖 20g.LB 培养基：蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化钠 10g/l3.2试验方法3.2.1 乳酸菌发酵上清液的制备将活化好的菌株以2% 的接种量接种于MRS培养基中 ,37 下培养24小时后 ,离心（4 ,6000r/min,15min）取发酵上清通过直径为0.22 纳米的威龙滤菌器过滤,取过滤后的上清液 ,置于 4的冰箱中保存并使用.3.2.2 指示菌悬浊液的制备将活化后的指示菌培养液接种于LB 培养基的试管中,培养 24 小时后得到菌悬液

3、待用.先配置 100ml生理盐水，加入250ml三角瓶中，再在其中加入20 粒左右玻璃珠，高压灭菌，然后用接种环将斜面上的菌苔刮下，接入三角瓶中，一般接1-2环接可，或者用少量的无菌生理盐水倒入斜面中，用接种环将菌苔刮下，然后倒入三角瓶中，将三角瓶震摇 1 分钟左右，即可生成菌悬液。3.2.3 抑菌物质的理化特性（ 1）不同热处理对菌株所产抑菌物质抑菌活性的影响分别在不同的温度（45 ,60 ,80 ,100 ）下将菌株发酵上清液处理10min, 大肠杆菌为指示菌进行抑菌试验,未经处理的发酵液作对照.welcome精品1)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基 加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml

4、 （下层），待其凝固。此外，将融化的LB 培养基冷却到50 左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml 加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。2)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基 表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm 、外径8mm 、高 10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。3) 温度处理 : 分别在不同的温度 （45 ,60 ,80 ,100 ）下将菌株发酵上清液处理 10min ）。4) 加入待捡药业：在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240 微升 ,勿使其外溢。5) 培养：加满后置 37 培养 16-18 小时。6)结果报告：观

5、察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。不同值对菌株产抑菌物质抑菌活性的影响1) 分别用 1mol LHCI 和 2mol LNaOH 将菌株发酵上清液调至不同的值（ 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0 ） ,并以大肠杆菌作指示菌进行抑菌的试验 ,从未接种的 MRS 液体培养基调节至上述相应的 P值作对照 .2)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基 加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml （下层），待其凝固。此外，将融化的LB 培养基冷却到50 左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml 加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。welcome精品3)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基 表面直接垂

6、直放上牛津杯（内径6mm 、外径8mm 、高 10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。4) PH 处理 : 分别用 1mol LHCI 和 2mol LNaOH 将菌株发酵上清液调至不同的值（ 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0 ）5)加入待捡药业：在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240 微升 ,勿使其外溢。6) 培养：加满后置 37 培养 16-18 小时。7)结果报告：观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。( 一 ) 蛋白酶处理对发酵上清液抑菌物质的影响分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分别在它们最适p H （ 2

7、.0 ， 7.6 ），用浓度为100 g/m L 的酶液在 37 处理1 h ，之后100 水浴1min灭活，处理后将p H调到起点值再测定抑菌能力。1)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基 加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml （下层），待其凝固。此外，将融化的LB 培养基冷却到50 左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml 加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。2)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基 表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm 、外径8mm 、高 10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。welcome精品3) 蛋白酶处理 : 分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分别在它们最适p H （2.0 ，7.6 ），用浓度为100 g/m L 的酶液在 37 处理 1 h ，之后 100 水浴 1min 灭活