动物细胞工程制药

1、第第 三三 章章动物细胞制药动物细胞制药第一节第一节 概概 述述细胞学说的建立细胞学说的建立组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养细胞工程学细胞工程学第二节第二节 动物细胞的形态和生理特点动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态 适应功能适应功能, ,形态各异。形态各异。 离体培养细胞分两类：离体培养细胞分两类： 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞贴壁细胞贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。面上生长。 两种形态：两种形态： 成纤维细胞型成纤维细胞型 上皮细

2、胞型上皮细胞型悬浮细胞悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠巢细胞，小鼠L929L929细胞。细胞。二、动物细胞的化学组成和代谢二、动物细胞的化学组成和代谢v1.1.动物细胞的化学组成动物细胞的化学组成v2.2.动物细胞的代谢动物细胞的代谢三、动物细胞的生理特点三、动物细胞的生理特点 细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为细胞分裂时间为121248h48h， 细胞的分裂细胞的分裂 周期周期

3、= =间期间期+ +分裂期分裂期 间期（间期（G G1 1+S+G+S+G2 2） 分裂期（分裂期（M M）G G1 1期：期：4 46h 6h 合成合成DNADNA聚合酶聚合酶 RNARNA合成合成S S期：期：6 68h DNA8h DNA合成合成G G2 2期：期：2 25h DNA5h DNA量加倍量加倍, , RNA RNA合成合成M M期：期：0.50.51h 1h 染色体分裂染色体分裂细胞代数为细胞分裂次数细胞代数为细胞分裂次数传代数表示细胞培养分种传代次数传代数表示细胞培养分种传代次数 细胞代数细胞代数= =传代数传代数分种数分种数/2/2 X=(logN-logNo) X=(

4、logN-logNo)log2log2 X X 代数代数 N N 培养最终细胞数培养最终细胞数 No No 培养起始细胞数培养起始细胞数 倍增时间倍增时间= =培养经过时间培养经过时间代数代数细胞生长需贴附于基质细胞生长需贴附于基质, ,并有接触抑制并有接触抑制现象。现象。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养原代培养 有限细胞系有限细胞系 无限细胞系无限细胞系动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对周围环境十分敏感. . 各种理化因素：渗透压、各种理化因素：渗透压、pHpH、离子浓度、离子浓度、剪切剪切 力、微量元素等。力、微量元素等。 动物细胞对培养基要

5、求高动物细胞对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位：动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体：合成蛋白质是分泌的粗面内质网的核糖体：合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。 动物细胞生产药物动物细胞生产药物缺点缺点: :培养条件高、成本贵

6、、产量低。培养条件高、成本贵、产量低。优点优点: :分泌胞外、纯化方便、翻译分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。后修饰糖基化，与天然产品一致。第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求 原代细胞原代细胞 二倍体细胞系二倍体细胞系 转化细胞系转化细胞系二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得原代细胞原代细胞 是直接取自动物组织器官是直接取自动物组织器官, ,经过粉经过粉碎消化而获得的细胞悬液（碎消化而获得的细胞悬液（10109 9/g/g）。）。 需要大量动物，费钱费劳力。需要大量动物，费钱费劳

7、力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。胞、淋巴细胞。 二倍体细胞系二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是染色体组型是2n2n核型；核型；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；可传代培养可传代培养5050代；代；无致瘤性。无致瘤性。 转化细胞系转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，

8、失去正常细胞特点，体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。发的，和人工的，从肿瘤组织中。4.4.融合细胞系融合细胞系(1)(1)仙台病毒融合法仙台病毒融合法(2)(2)聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法(3)(3)电融合法电融合法5.5.重组工程细胞系重组工程细胞系三、基因工程细胞构建和筛选三、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多的更有前景的是融合细在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。 被用构建工程细胞的动物细胞有：被用构建工程

9、细胞的动物细胞有： CHO-dhfr CHO-dhfr 、BHK-21BHK-21、 NamalwaNamalwa、VeroVero、 SP2/0SP2/0、 Sf-9 Sf-9 等细胞。等细胞。真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类：使用的载体有两类：病毒载体病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒质粒载体质粒载体病毒载体病毒载体 牛痘病毒：牛痘病毒： 用构建多价疫苗用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。用于基因治疗。 杆状病毒：杆状病毒： 用于外源基因表达。用于外源基因表达。 其

10、作为载体的其作为载体的 优点：优点： 双链双链DNADNA，易重组，易重组 插入插入7 78kb DNA8kb DNA不影响正常病毒粒子的形不影响正常病毒粒子的形成。成。 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；形成有感染力病毒粒子；多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的的蛋白质可占全部蛋白质的20%20%30%30%；用光学显微镜可看到多角体，可以此作为用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性

11、克隆。标记物，选阳性克隆。如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。基因。 质粒载体质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，都含有如下基本成分：都含有如下基本成分： 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。 能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选

12、基因载体导动物细胞常用方法是：基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法 磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法： 溶解的溶解的DNA DNA 加加NaNa2 2HPOHPO4 4和和CaClCaCl2 2 形成磷酸形成磷酸钙沉淀，钙沉淀， DNADNA被包在磷酸钙沉淀中，形成被包在磷酸钙沉淀中，形成DNADNA磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将时，则通过细胞吞噬作用而将DNADNA导入。导入。 电穿孔法：电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源使细胞膜出现瞬

13、时可逆性小孔，外源DNADNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。贝数低。 BHK-21: BHK-21: 从从5 5只无性别的生长只无性别的生长1 1天的地鼠幼天的地鼠幼鼠肾脏中分离的鼠肾脏中分离的; ;成纤维样细胞成纤维样细胞, ,核型为核型为2n=44;2n=44;培养基为培养基为DMEMDMEM加加7%7%胎牛血清。用于增胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。四、常用生产用动物细胞的特性四、常用生产用动物细胞的特性 CHO

14、-K1CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。离的上皮样细胞。 核型：核型： 2n=202n=202222。 培养基：培养基：DEMEDEME培养基培养基 0.1mmol/L0.1mmol/L次黄嘌呤，次黄嘌呤，0.1mmol/L0.1mmol/L胸苷，胸苷， 10%10%小牛血清，小牛血清， 加入脯氨酸。加入脯氨酸。 MRC-5MRC-5： 从正常男性肺组织中获得的人二从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。倍体细胞系。 核型为核型为2n=462n=46。 属成纤维细胞。属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。 同工酶同工酶G6PD BG6PD B

15、型。型。 有限寿命有限寿命42424646代。增殖速度较代。增殖速度较W1-38W1-38快，对不良环境敏感性较快，对不良环境敏感性较W1-38W1-38低。对人的低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。病毒敏感。用于生产疫苗。 Namalwa Namalwa： 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的类淋巴母细胞。建成的人的类淋巴母细胞。2.8%2.8%的高倍体率，的高倍体率，12121414条标记染色体。单条条标记染色体。单条X X，无，无Y Y。培养基为。培养基为RPMI 1640RPMI 1640，添加，添加7%7%胎牛血清。用于生产胎牛血清。用于生产干干扰素。扰素

16、。 Sf-9 Sf-9： 19831983年从亲代年从亲代IPLBIPLBSF21AESF21AE中克中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。它杆状病毒高度敏感。 通常用的培养基为通常用的培养基为GraceGrace培养基，添加培养基，添加3.3g/L 3.3g/L 水解乳蛋白和水解乳蛋白和3.3g/L3.3g/L酵母浸液酵母浸液, 10%, 10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。 Vero Vero： 从正常成年非洲绿

17、猴肾脏分离的。从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=602n=60； 培养基为培养基为199199培养基，加培养基，加5%5%胎牛血清；胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。灰质炎、狂犬病毒。 W1-38 W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为核型为2n=462n=46。成纤维细胞，能产生胶。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用原，培养基用BMEBME（EagleEagle Basal medium Basal medium）10%10%小牛血清，小牛

18、血清，pH7.2,pH7.2,同工酶为同工酶为G6PD BG6PD B型。型。倍增时间为倍增时间为24h24h，有限寿命有限寿命5050代。代。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。 SP2/0-Ag14 SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的细胞活性的BALB/c BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系胞系P3X63Ag8P3X63Ag8融合杂交瘤融合杂交瘤SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag 亚克隆亚克隆中分离获得，中分离获得， 能耐受能耐受8 8氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤 20g/ml20g/ml但在含但在含HAT HAT

19、 选选择培养基中不能存活。通常用培养基为择培养基中不能存活。通常用培养基为DMEMDMEM，添加添加10%10%胎牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞胎牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。和抗体。 五、细胞库的建立五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞库原始细胞库 生产用细胞库生产用细胞库原始细胞库原始细胞库 贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：贮存时须有该细胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史该细胞系的历史 该细胞系的特性该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果对各种有害因子的检查结果 生产用细胞库生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单

20、一安瓶来，从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。分装储存形成细胞库。 需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。的检查。需确定最高使用的传代数。第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式一、动物细胞大量培养的方法一、动物细胞大量培养的方法v优点优点:操作简单；培养条件比较均一；传质和操作简单；培养条件比较均一；传质和传氧较好等。传氧较好等。v缺点：难采用灌流培养。缺点：难采用灌流培养。v2.贴壁培养贴壁培养v优点：容易采用灌流培养。优点：容易采用灌流培

21、养。v缺点：操作麻烦；需要合适的贴壁材料和足缺点：操作麻烦；需要合适的贴壁材料和足够的面积；培养条件不易均一；传质和传氧够的面积；培养条件不易均一；传质和传氧较差等。较差等。v3.贴壁贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）悬浮培养（假悬浮培养）v（1）微载体培养）微载体培养v60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长长 v载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基带细胞悬浮于培养基 v20世纪世纪80年代正式用于工业化生产各种疫苗年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品和细胞产品v理想的微载体具备的条件：微载体表面性

22、质理想的微载体具备的条件：微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸展和增殖；微载体的材料无毒性；微载体的展和增殖；微载体的材料无毒性；微载体的材料是惰性的；微载体的比重为材料是惰性的；微载体的比重为1.030-1.045g/ml；直径在；直径在60-250m，大小均一；，大小均一；具有良好的光学透明性；基质的性质最好是具有良好的光学透明性；基质的性质最好是软性的；可耐软性的；可耐120高温，便于灭菌；经简高温，便于灭菌；经简单的适当处理后，可反复使用；原料充分，单的适当处理后，可反复使用；原料充分，制作简便，廉价。制作简便，廉价。v第一代微载体

23、：固体微载体第一代微载体：固体微载体v第二代微载体：多孔微载体第二代微载体：多孔微载体v多孔微载体分类：加钛；不加钛多孔微载体分类：加钛；不加钛v（2）包埋和微囊培养）包埋和微囊培养v载体材料分类：载体材料分类：v人工合成的高分子聚合物；人工合成的高分子聚合物；v糖类；糖类；v蛋白质。蛋白质。v包埋或微囊培养优点：包埋或微囊培养优点： 保护细胞，避免了保护细胞，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；有利于下游产物的纯化；可以采用多种有利于下游产物的纯化；可以采用多种生物反应器进行大规模培养。生物反应器进行大规模培养。v（3）结团培养）结团培养v原理：

24、细胞本身作为基质，相互贴附后，再原理：细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮培养的方法进行培养。用悬浮培养的方法进行培养。v（4）.多空载体培养法多空载体培养法 v近年发展的大规模高密度的培养方法近年发展的大规模高密度的培养方法 v多空载体是一种支撑材料，内部有网状小孔，细胞多空载体是一种支撑材料，内部有网状小孔，细胞可以在里面生长可以在里面生长 v即可用于悬浮细胞的固定化连续灌流培养，又可用即可用于悬浮细胞的固定化连续灌流培养，又可用于细胞的贴壁培养，细胞生长于内部，可免受搅拌于细胞的贴壁培养，细胞生长于内部，可免受搅拌等机械损伤等机械损伤 v常用：陶瓷，明胶，纤维素及衍生物，聚苯乙烯等常用

25、：陶瓷，明胶，纤维素及衍生物，聚苯乙烯等材料材料v（5）.中空纤维培养法中空纤维培养法 v模拟体内的三维培养状态，模拟体内的三维培养状态，细胞接种在中空纤维的外腔，细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使细胞高密血管供给营养，使细胞高密度生长度生长 v材料有硅胶，聚砜，聚丙烯材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为半透膜等，为半透膜二 动物细胞培养的操作方式第七节 动物细胞生物反应器v理想的动物细胞生物反应器具备的基本要求：理想的动物细胞生物反应器具备的基本要求：v制造生物反应器所用的所有材料必须无毒；制造生物反应器所用的所有材料必须无毒；具有良好的传质

26、、传热和混合的性能；具有良好的传质、传热和混合的性能；密封性能良好；。密封性能良好；。v最早于最早于1984年由英国科学家年由英国科学家Spier发明。发明。 v将细菌发酵罐进行改进。将细菌发酵罐进行改进。v该装置的主要特点是可以避免在向培养基中该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通气时气泡直接损伤细胞。通气时气泡直接损伤细胞。 v同时在采用微载体系统培养时，微载体不会同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。v笼式通气搅拌器的改进笼式通气搅拌器的改进- NBS装置装置v作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，进，NBS装置中分别包括笼式的通气腔装置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔。和消泡腔。 v气液交换在由气液交换在由200目不锈钢丝网制成目不锈钢丝网制成的通气腔内实现