基因工程-载体构建蛋白表达

1、原核表达载体构建原核表达载体构建真核真核表达载体构建表达载体构建提高蛋白表达的途径提高蛋白表达的途径真核细胞与原核细胞的比较真核细胞与原核细胞的比较 特征特征 原核细胞原核细胞 真核细胞真核细胞细胞膜细胞膜有（行使多种功能）有（行使多种功能） 有有核膜核膜 无无 有有染色体染色体裸露裸露DNA，无组蛋白，无组蛋白 DNA与组蛋白结合与组蛋白结合核外核外DNA 含有质粒含有质粒DNA 线粒体与叶绿体线粒体与叶绿体DNA胞质区域化胞质区域化 简单（无细胞器）简单（无细胞器） 复杂有各种细胞器复杂有各种细胞器细胞骨架细胞骨架 无无 有（有（MT、MF、IF）核糖体核糖体 70S型（型（30S和和50

2、S） 80S型（型（40S和和60S） 细胞增殖细胞增殖 无丝分裂无丝分裂 有丝分裂、减数分裂有丝分裂、减数分裂原核细胞与真核细胞的区别原核细胞与真核细胞的区别原核表达与真核表达的区别原核表达与真核表达的区别 原核基因表达以操纵原核基因表达以操纵子形式进行子形式进行 转录和翻译几乎同时转录和翻译几乎同时进行进行 真核转录在核内进行，真核转录在核内进行，先形成先形成hnRNAhnRNA, ,再加工再加工剔除内含子，外显子剔除内含子，外显子相连，相连，55端加帽，端加帽， 33端加端加poly Apoly A尾巴。尾巴。 翻译在胞浆的核糖体翻译在胞浆的核糖体上进行上进行乳糖操纵子学说(原核基因的表

3、达调控)真核细胞的复制、转录、翻译真核细胞的复制、转录、翻译第一节第一节 外源目的基因在原核外源目的基因在原核细胞中的表达细胞中的表达 原核基因表达载体的构成原核基因表达载体的构成 常见的原核细胞表达载体系统常见的原核细胞表达载体系统 外源目的基因在原核细胞中的表达形式外源目的基因在原核细胞中的表达形式 在原核细胞中高效表达目的基因在原核细胞中高效表达目的基因一、原核基因表达载体的构成一、原核基因表达载体的构成1)1) DNADNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统 复制子复制子: : 扩增扩增 选择标记：筛选选择标记：筛选2)2) 外源基因的转录系统外源基因的转录系统 启动子启

4、动子 抑制物基因抑制物基因 转录终止子转录终止子3)3) 蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统 核糖体结合位点核糖体结合位点 翻译起始密码子翻译起始密码子 翻译终止密码子翻译终止密码子启动子启动子多克隆位点多克隆位点终止子终止子ATGTAA目的基因目的基因DNA复制起始位点复制起始位点耐药性基因耐药性基因阻遏物基因阻遏物基因表达载体表达载体 pBR322old-style general purpose plasmid4362 bp1)1) DNADNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统 复制子复制子：包含复制起始位点（：包含复制起始位点（oriori) )和有关序和有关序列在内的列

5、在内的DNADNA片段。片段。 常见复制子有常见复制子有pMB1, p15A,Col E1pMB1, p15A,Col E1和和pSC101pSC101等。等。 前前3 3者为松弛复制型，含者为松弛复制型，含pSC101pSC101复制子的质复制子的质粒载体严谨复制型。粒载体严谨复制型。 选择标记选择标记：抗生素抗性基因：抗生素抗性基因 2)2)外源基因的转录系统外源基因的转录系统 启动子启动子: :能被宿主能被宿主RNARNA聚合酶特异识别和结合并指导目的聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的基因转录的DNADNA序列。启动子具有序列特异性、启动序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作

6、用的位置特性和种属特异性。的方向性、作用的位置特性和种属特异性。 诱导型启动子：诱导型启动子：LacLac、TrpTrp、TacTac等等 组成型启动子：组成型启动子：T7T7噬菌体启动子噬菌体启动子 抑制物基因抑制物基因: :其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。可使拟制物失活，启动子功能恢复。 转录终止子：转录终止子：终止终止RNARNA聚合酶转录的聚合酶转录的DNADNA序列。序列。 本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子，本正终止子：

7、不需要其他蛋白辅助因子， 依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如因子）因子） 防止转录过头防止转录过头3 3）蛋白质的翻译系统）蛋白质的翻译系统 影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点结合位点(SD(SD序列序列) )、起始密码与、起始密码与SDSD序列之间序列之间的距离和碱基组成、的距离和碱基组成、mRNAmRNA的二级结构、的二级结构、 mRNAmRNA上游的上游的55端非翻译序列和蛋白编码区的端非翻译序列和蛋白编码区的55端序列端序列核糖体结合位点核糖体结合位点翻译起始密码子翻译起始密码子

8、 翻译终止密码子翻译终止密码子核糖体结合位点核糖体结合位点：原核生物转录起始位点：原核生物转录起始位点(RBS)(RBS)下游的一段下游的一段DNADNA序列，序列，由由SDSD序列和序列和起始密码子组成起始密码子组成。 SDSD序列大约序列大约3-9bp,3-9bp,位于位于ATGATG上游上游3-11bp3-11bp处。处。SDSD序列可与核序列可与核糖体糖体16S rRNA16S rRNA特异配对而与宿主核糖体特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌结合。大肠杆菌SDSD序列为序列为 5A5AGGAGGGAGG3G3，其中，其中GGAG 4GGAG 4碱基发生任碱基发生任何改变均大幅度降低翻

9、译效率。何改变均大幅度降低翻译效率。翻译起始密码子：翻译起始密码子：一般为一般为ATG(AUG),ATG(AUG),编码甲编码甲硫氨酸硫氨酸(Met),(Met),也有采用其他密码子。也有采用其他密码子。 影响翻译效率的因素有影响翻译效率的因素有：SDSD序列、翻译序列、翻译起始密码子、起始密码子、 SDSD序列和翻译起始密码序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道，子之间的距离和碱基组成等。据报道， SDSD序列后面为序列后面为AAAAAAAA或或UUUUUUUU时，翻译起始时，翻译起始效率最高，而当为效率最高，而当为CCCCCCCC或或GGGGGGGG时效率最时效率最低。低。翻译

10、终止密码子翻译终止密码子：它核糖体相遇时，能使：它核糖体相遇时，能使核糖体从核糖体从mRNAmRNA模板上脱落，终止翻译过模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子子RF1RF1和和RF2RF2调控。调控。 RF1RF1识别识别UAAUAA和和UAG, UAG, RF2RF2识别识别UAAUAA和和UGAUGA，故选，故选UAAUAA作终止密码作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉子。可将几个终止密码子串联。据悉UAAUUAAU为有效终止密码子。为有效终止密码子。二、常见的原核细胞表达载体系统二、常见的原核细胞表达载体系统 Plac启动子表

11、达系统启动子表达系统 PL 和和PR启动子表达载体系统启动子表达载体系统 T7噬菌体启动子表达载体系统噬菌体启动子表达载体系统三、外源基因在原核细胞中的表达形式三、外源基因在原核细胞中的表达形式 包涵体包涵体 融合蛋白融合蛋白 寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白 分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白（一）包涵体（一）包涵体 外源基因的高表达产物在原核细胞中外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。或许也有一些受体不溶性蛋白质结构。或许也有一些受体细胞本身的蛋白质。细胞本身的蛋白质。 包涵体具有正确的氨基酸序列，但空包涵体具有正确的氨

12、基酸序列，但空间构象错误，故没有生物学活性。间构象错误，故没有生物学活性。 需要复性需要复性（二）融合蛋白（二）融合蛋白 定义定义：将外源目的蛋白的基因与受体菌：将外源目的蛋白的基因与受体菌自身蛋白基因重组，但不改变两个基因自身蛋白基因重组，但不改变两个基因的阅读框而表达出的蛋白。的阅读框而表达出的蛋白。外源基因外源基因宿主基因宿主基因融合蛋白的特点融合蛋白的特点 1. 稳定性好稳定性好 单独的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被单独的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被原核细胞中的蛋白水解酶所降解。原核细胞中的蛋白水解酶所降解。 融合蛋白中，外源蛋白在菌体自身蛋白的引导融合蛋白中，外源蛋白在菌体

13、自身蛋白的引导下，能正确折叠，形成杂合构象，封闭了暴露下，能正确折叠，形成杂合构象，封闭了暴露在分子表面的蛋白酶切割位点。在分子表面的蛋白酶切割位点。融合蛋白的特点融合蛋白的特点2. 表达效率较高表达效率较高 转录和翻译由宿主菌的固有设施控制。转录和翻译由宿主菌的固有设施控制。3. 易于分离纯化易于分离纯化 利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源

14、目的蛋白。肽键，最终得到外源目的蛋白。（三）寡聚型的外源蛋白（三）寡聚型的外源蛋白多个多个外源蛋白基因串联外源蛋白基因串联 多表达单元的重组多表达单元的重组 多顺反子重组多顺反子重组 多编码序列重组多编码序列重组 多表达单元的重组多表达单元的重组： 每个表达单元都含有独立的启动子、终每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、止子、SD序列、起始密码和终止密码。序列、起始密码和终止密码。 -表达分子量较大的蛋白，表达分子量较大的蛋白， 不需要裂解处理。不需要裂解处理。启动子相互竞争启动子相互竞争ABCPromoterSDSDSD 多顺反子重组多顺反子重组： 多拷贝的外源基因有各自的多拷贝的外源基因

15、有各自的SD序列、序列、翻译起始和终止密码，但转录在共翻译起始和终止密码，但转录在共同的转录启动子和终止子下进行。同的转录启动子和终止子下进行。-表达中等外源蛋白。表达中等外源蛋白。ABCPromoterSDSDSD 多编码序列重组多编码序列重组： 多个基因串联，利用同一套转录调控多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。的位点。ABCPromoter蛋白酶切位点(四四) 整合型外源蛋白整合型外源蛋白 将要表达的外源基因整合到染色体的非必将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编

16、码区，使之成为染色体结构的一部分，而需编码区，使之成为染色体结构的一部分，而稳定遗传稳定遗传 本质为本质为DNADNA同源交换。同源交换。 待整合的外源基因两侧必须带一段与染色待整合的外源基因两侧必须带一段与染色体完全同源的的序列。同时将可控的表达元件体完全同源的的序列。同时将可控的表达元件和选择性标记基因连接在一起。和选择性标记基因连接在一起。 一般选择不能自主复制的质粒或温度敏感一般选择不能自主复制的质粒或温度敏感型质粒。型质粒。（五）分泌型外源蛋白（五）分泌型外源蛋白 通过运输或分泌方式穿越细胞外膜进入通过运输或分泌方式穿越细胞外膜进入培养基。培养基。 需在需在N N端加端加15-301

17、5-30个氨基酸组成的个氨基酸组成的信号信号肽序列肽序列。信号肽。信号肽N N端的最初几个氨基酸为端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水性氨基酸。当蛋白分泌到大肠杆菌细胞性氨基酸。当蛋白分泌到大肠杆菌细胞内外膜之间的外周质时，信号肽被信号内外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶切割。肽酶切割。分泌型表达的优点分泌型表达的优点 能使蛋白正确折叠能使蛋白正确折叠 分泌到胞外周质的蛋白较稳定，不易被分泌到胞外周质的蛋白较稳定，不易被胞内的蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨胞内的蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨酸（酸（Met)。 简化了发酵后处理工艺。简化了发酵后

18、处理工艺。缺点：表达量不高，有时信号肽不被切割缺点：表达量不高，有时信号肽不被切割或切割不当。或切割不当。四、在原核细胞中高效表达目的基因四、在原核细胞中高效表达目的基因（一）高效表达外源基因的基本策略（一）高效表达外源基因的基本策略（二）目的基因表达水平的提高与检测（二）目的基因表达水平的提高与检测（一）高效表达外源基因的基本策略（一）高效表达外源基因的基本策略1.载体构建的优化载体构建的优化a) 选用强启动子、强终止子选用强启动子、强终止子b)使使SD序列与核糖体序列与核糖体16S rRNA的碱基完全配对的碱基完全配对c)调整调整SD序列与起始密码序列与起始密码ATG之间的距离之间的距离d

19、)防止核糖体结合位点附近序列转录后的防止核糖体结合位点附近序列转录后的mRNA形成形成二级结构二级结构2.提高稀有密码子的表达频率提高稀有密码子的表达频率 通过点突变方法改造外源基因的稀有密码通过点突变方法改造外源基因的稀有密码3.构建基因高表达受体菌构建基因高表达受体菌 大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统4.提高外源基因表达产物的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性 采用分泌型表达系统采用分泌型表达系统 表达为融合蛋白表达为融合蛋白 构建包涵体表达系统构建包涵体表达系统 选用蛋白酶缺陷型菌株作为受

20、体菌选用蛋白酶缺陷型菌株作为受体菌 外源蛋白中对水解酶敏感的序列进行修外源蛋白中对水解酶敏感的序列进行修饰和改造饰和改造（二）目的基因表达水平的提高与检测（二）目的基因表达水平的提高与检测1.采用定点诱变技术，使核糖体结合位点采用定点诱变技术，使核糖体结合位点(SD序列，起始密码子序列，起始密码子ATG)的周围碱基发生改变，的周围碱基发生改变，去除该区域的二级结构，以便提高基因表达去除该区域的二级结构，以便提高基因表达水平。水平。2.利用不同表达水平的宿主菌株利用不同表达水平的宿主菌株3.在目的基因在目的基因DNA下游接一段下游接一段DNA序列，可以序列，可以稳定稳定mRNA从而提高翻译效果。

21、从而提高翻译效果。4.通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强度、质粒拷贝数或诱导物的量度、质粒拷贝数或诱导物的量目的基因表达产物的检测目的基因表达产物的检测 SDS-PAGE和放射自显影第二节第二节 外源目的基因在真核细胞中外源目的基因在真核细胞中的表达的表达真核表达载体的功能元件真核表达载体的功能元件酵母表达系统酵母表达系统真核表达载体的功能元件真核表达载体的功能元件 启动子元件启动子元件 增强子元件增强子元件 加加Poly(A)信号信号 剪接信号剪接信号与翻译相关的元件与翻译相关的元件增强子元件增强子元件 增强子：能够增强启动子转录活性的增强子：能够增

22、强启动子转录活性的DNA序列。可以在转录起始位点上游或序列。可以在转录起始位点上游或与启动子相距较远的位置上起作用。与启动子相距较远的位置上起作用。 可以将几个增强子串联使用，从而大幅可以将几个增强子串联使用，从而大幅度提高启动子的转录水平。度提高启动子的转录水平。二、酵母表达系统二、酵母表达系统 酵母基因表达载体的组成元件酵母基因表达载体的组成元件 酵母基因表达载体的类型酵母基因表达载体的类型 表达外源基因的酵母宿主菌表达外源基因的酵母宿主菌酵母基因表达载体的组成元件酵母基因表达载体的组成元件 DNA复制起始序列复制起始序列 选择（筛选）标记选择（筛选）标记 启动子启动子 分泌信号序列分泌信

23、号序列 终止子终止子 有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区启动子启动子 长度约长度约1-2kb。其上游有各种调控序列，例如。其上游有各种调控序列，例如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等。启动子下游有转录起始位点和序列等。启动子下游有转录起始位点和TATA序列。序列。 TATA序列可被转录因子蛋白识别、结序列可被转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物。合并形成转录起始复合物。 强启动子：酵母磷酸甘油酯激酶强启动子：酵母磷酸甘油酯激酶(PGK)、甘油、甘油醛磷酸脱氢酶醛磷酸脱氢酶(GAPDH)基因启动子等基因启动子等分泌信号序列分泌信号序列 分泌信号

24、序列分泌信号序列-引导分泌蛋白从胞内到胞外，引导分泌蛋白从胞内到胞外，并对蛋白质翻译后加工起作用。并对蛋白质翻译后加工起作用。 有有-因子前导肽序列，蔗糖酶信号肽序列，因子前导肽序列，蔗糖酶信号肽序列，酸性磷酸酯酶信号肽序列等。其中酿酒酵母酸性磷酸酯酶信号肽序列等。其中酿酒酵母-因子因子preproprepro信号序列最经典信号序列最经典。 理论上，可将外源基因与其天然信号序列、酿理论上，可将外源基因与其天然信号序列、酿酒酵母酒酵母-因子前导肽或毕赤酵母酸性磷酸酶因子前导肽或毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽等任意一种结合共阅读框融合，构建分信号肽等任意一种结合共阅读框融合，构建分泌型表达质粒。泌型表达

25、质粒。酵母基因表达载体的类型 自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体 整合型质粒载体整合型质粒载体 着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体 酵母人工染色体酵母人工染色体表达外源基因的酵母宿主菌表达外源基因的酵母宿主菌 酿酒酵母酿酒酵母 高密度培养产生乙醇积累，限制了酵母高密度培养产生乙醇积累，限制了酵母的继续生长和蛋白分泌的继续生长和蛋白分泌 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母 甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如关酶基因的高效表达，如AOX1的表达产的表达产物可在细胞中高水平积累。物可在细胞中高水平积累。Yeast Expression System

26、30 years ago,Koichi Ogata discovered some yeast could live using carbinal as sole carbon source. The promoter of AOX1 can be activated strongly by carbinal. Whereas that of AOX2 can only be weekly elicited. So,the former was employed widely in lab research and industrial scale up. 以以AOX1为启动子，以为启动子，以AOX1基因缺失突基因缺失突变体为受体细胞，可高效表达外源基因。变体为受体细胞，可高效表达外源基因。 或用组氨酸脱氢酶突变体作为受体细胞，或用组氨酸脱氢酶突变体作为受体细胞，从而对携带从而对携带his标记基因的转化子进行筛标记基因的转化子进行筛选。选。 还有蛋白酶缺陷宿主菌还有蛋白酶缺陷宿主菌巴斯德毕赤酵母表达系统的优点巴斯德毕赤酵母表达系统的优点优点优点：1)1) 与酿酒酵母相比，产酒精较少与酿酒酵母相比，产酒精较少2)2) 适合高密度培养适合高密度培养3)3)