细菌和噬菌体的重组和连锁

1、细菌和噬菌体的重组和连锁基本知识 细菌是单细胞，它的遗传物质是一个大型的环状核酸分子，称之为基因带，也可称为染色体。若细菌丧失产生某种营养物质（如氨基酸）的能力就称为营养缺陷型，相对于缺陷型的野生菌株叫原养型。 病毒的结构是由蛋白质外壳和包裹在中间的一个单一的核酸分子（可称基因带或染色体）组成。One circular chromosome (4-5Mb) 原养型及原养型及营养缺陷型营养缺陷型鉴别鉴别: : 基因型的表示：基因型的表示：用它们不能合用它们不能合成的物质的前成的物质的前三个字母三个字母 7.1 细菌的遗传分析细菌的杂交 以大肠杆菌为例，大肠杆菌K12中两个菌株A和B，菌株A是供体

2、，含有F因子（F质粒），记作F+，菌株B是受体，没有F因子，记作F-。F因子又称性因子或致育因子，它是能独立增殖的环状DNA分子。 F+细菌的表面有称作性伞毛的细长纤毛。当F+细菌与F-细菌结合时，F因子通过性伞毛从F+细菌转移到F-细菌，原来的细菌还仍为F+。不过染色体很少通过结合而转移到F-细菌，所以染色体上的基因的重组频率很低。杂交杂交实验实验Lederberg 和和 Tatum 1946ABABAB回复突变回复突变or重组重组？杂交实验杂交实验Lederberg 和和 Tatum 1946AB CD AB CDABCD A A品系：品系：metmet biobio thithi leu

3、leu thrthr（thithi：硫胺素：硫胺素B1B1） B B品系：品系：metmet biobio thithi leuleu thrthr A A+B BA A+B B 基本培基本培 养基养基 metmet biobio thithi leuleu thrthr出现频率出现频率:1/10:1/107 7（示：杂交（示：杂交实验）实验）达尔夫达尔夫Davis U型管实验型管实验遗传物质的单方向转移遗传物质的单方向转移Hayes实验实验A: met- thr+ leu+ thi+B: met+ thr- leu- thi-Donor： AReceptor：B 大剂量链霉素大剂量链霉素 A

4、 A品系品系 无影响无影响 大剂量链霉素大剂量链霉素 B B品系品系 阻止了重组阻止了重组 F细菌可以把细菌可以把F因子传给后代。因子传给后代。 F细菌经吖啶橙处理细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不因子丢失，丢失后不再出现。再出现。 F可以和可以和F杂交，而不能和杂交，而不能和F杂交。杂交。 F和和F杂交后代皆为杂交后代皆为F，而且可以以，而且可以以107频频率获得重组体后代。率获得重组体后代。Hfr菌株 因为F因子和细菌的DNA分子都是环状的，在环状的细菌染色体和环状的F因子间通过一个交换，环状F因子就整合到环状的细菌染色体上。 F因子整合到细菌染色体上的菌株就是高频重组菌株，称为Hfr菌

5、株。高频重组菌株（Hfr菌株）跟菌株B（F-）杂交时，细菌染色体上基因的重组频率很高，即出现重组子的频率很高。图示 F因子整合到细菌染色体的过程） 相同相同1、都能和、都能和F杂交。杂交。2、杂交都要通过接合管和受体菌相联接。、杂交都要通过接合管和受体菌相联接。3、高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们、高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。都是作为一种供体。 不同不同1、产生重组子频率不同，、产生重组子频率不同，HfrF为为104，FF为为107。2、 FF后代后代F， HfrF后代后代F。3、 F细菌经吖啶橙处理变成细菌经吖啶橙处理变成F，Hfr经吖啶橙经吖啶橙处理仍

6、为处理仍为Hfr。中断杂交技术：把Hfr细菌与F-细菌混合培养，每隔一定时间取样，将试样搅拌并稀释后在选择培养基上培养，使其只有重组子类型可以生长，分析Hfr染色体上基因进入受体细胞（F-细菌）的顺序各所需时间（分钟），这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术。巴斯德实验室，巴斯德实验室，Elie Wolliman和和Francois Jacob（1 1）.Wollman.Wollman和和JacobJacob的实验的实验 要解决的问题是：要解决的问题是： HfrHfr细菌在交配中，什么时候把基因转移给细菌在交配中，什么时候把基因转移给F F细菌。细菌。 方法

7、：把两个菌株混在一起，进行杂交方法：把两个菌株混在一起，进行杂交将二菌株在培养液中通气培养，将二菌株在培养液中通气培养，HfrHfr细菌与细菌与F F细菌开始接触，细菌开始接触，形成接合管。每隔一定时间取样搅拌，断开结合管，使配对形成接合管。每隔一定时间取样搅拌，断开结合管，使配对的细菌分开。然后稀释菌液，防止再度配对。的细菌分开。然后稀释菌液，防止再度配对。将上述菌液涂布在含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮氨酸将上述菌液涂布在含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮氨酸的培养基上。这样，带的培养基上。这样，带thrthr+ +和和leuleu+ +的的HfrHfr菌株对链霉素敏感；菌株对链霉素敏感；而带有

8、而带有strstrr r的的F F菌不能合成苏氨酸和亮氨酸，菌不能合成苏氨酸和亮氨酸，都不能生长都不能生长。只有带只有带thrthr+ +和和leuleu+ +的的HfrHfr菌和带有菌和带有strstrr r的的F F菌的重组子可以生菌的重组子可以生长。长。 把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检测。我们只需要把发生重组的重组子检出。都能生长。影响检测。我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本

9、培养基中培养选择组子，如在基本培养基中培养选择thrthr+ +leuleu+ +重组子。这时重组子。这时thrthr+ +leuleu+ +为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。 如何检出某一基因的重组子如何检出

10、某一基因的重组子? 把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是因型必定是thrthr+ +leuleu+ +strstrr r。因为只有这种重组。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体子才能生长。并说明供体thrthr+ +和和leuleu+ +已进入已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因择的基因thrthr+ +和和leuleu+ +为选择标记基因，而始为选择标记基因，而始终不被选择的终不被选择的strstrs s为反选择标记基因，而

11、那为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。记。 对每一时刻的重组对每一时刻的重组 thr+leu+strr的菌落影印培的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖养接种到不同的培养基上（如乳糖lae+ 伊伊红红+美兰美兰红色，反之则是粉红色的。红色，反之则是粉红色的。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得图（出现的频率和持续时间，得图（Hfr的非选的非选择标记基因进入择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。选择标记在各个

12、时间出现的频率作图）。在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因各培养基分别具有不同的营养缺陷或某种抑制性物质存在。 WollmanWollman和和JacobJacob对对重组子重组子thrthr+ +leuleu+ +strstrr r进行菌落影印培进行菌落影印培养实验。分析养实验。分析HfrHfr染色体上其它非染色体上其它非选择性标记基因选择性标记基因进入进入F F细菌的顺细菌的顺序和所需时间序和所需时间（分钟），绘制（分钟），绘制连锁图。连锁图。（2 2）. . 实验结果及分析实验结果及分析9 9v从从HfrHfr菌株某基因在菌株某基因在F F

13、细细菌中出现开始，随着时间菌中出现开始，随着时间的推移，具有该基因的菌的推移，具有该基因的菌落逐渐增加，直到某一百落逐渐增加，直到某一百分数为止。分数为止。l而且某一基因出现的时间愈而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。早，它达到的频率愈高。 v如叠氮化钠抗性基因出现最如叠氮化钠抗性基因出现最早，在早，在24分钟时就达到大约分钟时就达到大约90的的F-菌落；半乳糖发酵基因菌落；半乳糖发酵基因出现最迟，即使在混和后出现最迟，即使在混和后60分钟也只有分钟也只有30的菌落属于的菌落属于能利用型。能利用型。（3 3）. .结论结论染 色 体 从 一 端 开 始 ， （ 这染 色 体 从 一

14、端 开 始 ， （ 这一端称为原点（一端称为原点（originorigin）或）或OO），），以 线 性 方 式 进 入以 线 性 方 式 进 入 F F- -细 胞 中 。 基 因细 胞 中 。 基 因离原点越远，进入离原点越远，进入F F细胞越迟。细胞越迟。离 开 原 点 较 远 的 基 因 ， 可 能 在 转离 开 原 点 较 远 的 基 因 ， 可 能 在 转移 过 程 停 止 以 前 ， 仍 未 转 移 ， 因移 过 程 停 止 以 前 ， 仍 未 转 移 ， 因而 斜 率 较 低 ， 达 到 的 最 高 值 也而 斜 率 较 低 ， 达 到 的 最 高 值 也较小。如果让较小。如果

15、让HfrHfr F F杂交继续进杂交继续进行 ， 长 达 二 小 时 ， 然 后 使 之 中行 ， 长 达 二 小 时 ， 然 后 使 之 中断，这样发现某些断，这样发现某些F F受体转变为受体转变为HfrHfr。致育因子是最后转移到受体。致育因子是最后转移到受体的，并使它们成为供体其效率很的，并使它们成为供体其效率很低，是因为致育因子是线性染色低，是因为致育因子是线性染色体 最 后 一 个 单 位 ， 它 最 晚 进 入体 最 后 一 个 单 位 ， 它 最 晚 进 入 F F细胞。细胞。（4 4）. . 作图作图 WollmanWollman和和JacobJacob认为，根据中断杂交技术，

16、用杂交后认为，根据中断杂交技术，用杂交后HfrHfr基基因最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。因最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。 遗传距离用时间（分钟）为单位，譬如，遗传距离用时间（分钟）为单位，譬如，tonton在在aziazi开始进入开始进入F F细胞后细胞后2 2分钟进入，那么分钟进入，那么aziazi和和tonton间的遗传距离为间的遗传距离为2 2单单位，其它依此类推。位，其它依此类推。细菌的交换过程 重组子(即重组类型)的产生是由于不同的DNA分子之间发生交换的结果。细菌重组子的产生是由于细菌染色体（F-染色体）与供体DNA分子（部分Hfr染色体）之

17、间发生交换的结果。但发生单交换是没有用的，只有发生偶数的交换才能产生有活性的重组子。 根据重组子频率来确定两基因之间的距离并绘制出连锁图，这种根据重组频率作图的方法称之为重组作图。ABbabaABABbaABba+ABba部分二部分二倍体倍体Hfr lacHfr lac+ +adeade+ +(str(strs s) ) F F- - lac lac- -adeade- -(str(strr r) )完全培养基混合培养完全培养基混合培养基本培养基（基本培养基（F F- -adeade+ + 菌落菌落）（无腺嘌呤、加链霉素（无腺嘌呤、加链霉素) )EMBEMB培养基（影印培养）培养基（影印培养）

18、F F- -adeade+ +laclac- -基因间发生交换基因间发生交换F F- -adeade+ +laclac+ +基因间未发生交换基因间未发生交换加乳糖加乳糖实验方法：实验方法： 将重组子菌落影印培养在加有将重组子菌落影印培养在加有曙红和美蓝的培养基上：以检曙红和美蓝的培养基上：以检验能否利用乳糖。验能否利用乳糖。如能发酵乳糖（如能发酵乳糖（lac+），），菌落是紫红色的。菌落是紫红色的。如不能利用（如不能利用（lac-），菌落），菌落是粉红色的。是粉红色的。试验结果：亲组合试验结果：亲组合 52 重组合重组合 15计算重组频率：计算重组频率： 重组菌落数重组菌落数/ /总菌落数总菌

19、落数100 % 100 % =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) 100% 100% = 15/(52+15) = 15/(52+15) 100% 20% 100% 20% 已知中断杂交实验该两个基因相距已知中断杂交实验该两个基因相距1分钟分钟, 重组作图与中断杂交作图的图距关系重组作图与中断杂交作图的图距关系: 1分钟图距分钟图距 20% 重组值重组值前面提到，时间单位接近前面提到，时间单位接近2 2分钟时，测得的基因间的距离，不太可分钟时，测得的基因间的距离，不太可靠，故应采用

20、比较稳定的重组作图法。靠，故应采用比较稳定的重组作图法。 F 因子（ F 质粒）是带有部分细菌染色体的带有部分细菌染色体的F因子。因子。Hfr通过交换，可以形成带有部分细菌染色体的F 因子，而F 因子又可通过交换整合到细菌染色体上的原来位置，回复到以前的Hfr状态。 F 因子连同它所带有的部分细菌染色体可一起转移到F-细胞，并形成部分二倍体。这一特性叫做性导。 F 因子转移到F-细胞的转移速率近于F因子。但它把细菌染色体转移过去的效率比Hfr低得多。不过Hfr的致育因子（F因子）极少进入F-细胞。 F 品系转变成品系转变成Hfr品系的频率要高于品系的频率要高于F品系。品系。 F 变成变成Hfr

21、时时F 因子整合到相同位点上，而因子整合到相同位点上，而F变变成成Hfr时可整合到不同位点。时可整合到不同位点。 F F 高频传递特定的基因，形成部分二倍体，高频传递特定的基因，形成部分二倍体，而而FF产生产生F但不转移任何基因，或以但不转移任何基因，或以107将将宿主的基因转移，所转移的基因是不同的。宿主的基因转移，所转移的基因是不同的。 Hfr F将宿主的基因按顺序转入受体，将宿主的基因按顺序转入受体，产生重组产生重组子频率较高，子频率较高，为为10。但受体仍为但受体仍为F（？）。性别性别细菌状态细菌状态F因子状态因子状态F-无无F因子因子F+F因子为游离状态因子为游离状态HfrF因子整合

22、到宿主染色体上因子整合到宿主染色体上F 带有部分宿主染色体的带有部分宿主染色体的F因子，因子，为游离状态为游离状态小结：小结：1、细菌细胞的两种性别、四种状态：、细菌细胞的两种性别、四种状态： F+F-丢失丢失杂交杂交 F+Hfr整合到整合到E.coli 染色体染色体规则脱离规则脱离E.coli 染色体染色体 FHfr 回复到回复到Hfr 染色体染色体不规则脱离不规则脱离E.coli 染色体染色体2、F+、 F-、Hfr、F的关系的关系转变关系转变关系F+F- 低频重组低频重组HfrF- 高频重组高频重组FF- 一般为低频重组，但对所携一般为低频重组，但对所携 带的带的基因是高频重组。基因是高

23、频重组。重组频率区别重组频率区别7.2 噬菌体的遗传分析烈性噬菌体：噬菌体侵染细菌后，把宿主菌的生物合成装置接收过来，合成更多的噬菌体，最后使细菌细胞烈解并释放出很多子代噬菌体。这种使宿主菌烈解的噬菌体叫烈性噬菌体。如T2噬菌体。温和噬菌体：噬菌体侵染细菌后，细菌好象未被感染一样能继续增殖。如不经诱导宿主菌不发生烈解，这种噬菌体叫温和噬菌体。这种现象叫溶源性，这样的细菌叫溶源性细菌或溶源菌。如P22、P1和噬菌体。 噬菌斑的鉴定（噬菌体遗传特性的鉴定） 一个噬菌斑中的噬菌体在遗传上是均一的，相当于一个克隆。由于噬菌体的基因型不同，噬菌斑可以是大的或小的，边缘清晰的或模糊的；另外噬菌体的宿主范围（host range）也可能不同，有些噬菌体可以侵染和裂解某些细菌但不能侵染和裂解另外一些细菌，根据这些就可以鉴定噬菌体遗传特性。 T2突