基因工程目的基因的分离

1、一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（简称限制酶限制性核酸内切酶（简称限制酶 restriction enzyme），是指在），是指在细胞内能够识别双链细胞内能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在此位分子中特定的核苷酸序列，并在此位点对点对DNA分子进行切割的一种内切酶。分子进行切割的一种内切酶。 1952年，年，Luria和和Human发现宿主控制性限制现象。发现宿主控制性限制现象。1、 限制限制修饰系统修饰系统 包括限制酶和甲基化酶。包括限制酶和甲基化酶。1968年，年，Meselson和和Yuan，Linn和和Arber从从E.coli菌株菌株K和和B中发现了

2、中发现了型限制性核酸内切酶，接着，型限制性核酸内切酶，接着，Smith和和Wilcox于于1970年分离纯化了第一个年分离纯化了第一个型限制性核酸内切酶。型限制性核酸内切酶。 宿主细胞对噬菌体感染的限制宿主细胞对噬菌体感染的限制-修饰作用修饰作用（2）型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。型型酶需要酶需要Mg2+、ATP和和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿DNADNA转

3、位，而后距其识别位点转位，而后距其识别位点5 5侧数千个碱基处随机切割。侧数千个碱基处随机切割。 III型酶与型酶与型酶基本相似，但是型酶基本相似，但是IIIIII型酶具有特异性的切型酶具有特异性的切割位点，在识别点的割位点，在识别点的3端端2426bp处。处。 它的切点与识别位点是一致的。由于它的切点与识别位点是一致的。由于型酶的该特点，型酶的该特点，且反应中不需要且反应中不需要ATP、S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而是基因工程中使用的主要工具酶。是基因工程中使用的主要工具酶。 （1）型和型和IIIIII型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分为限制

4、性核酸内切酶分为3 3种类型：种类型：I I型、型、IIII型和型和IIIIII型型（1）识别双链）识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，其长度一般为分子的特定核苷酸序列，其长度一般为48个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。 其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，N是代表任是代表任意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。（2）具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点A A、粘性末端、粘性末端a a、55突出粘性末端突出粘性末端如限制酶如

5、限制酶PstPst- -, ,它识别它识别6 6核苷酸序列，产生核苷酸序列，产生4 4核核苷酸苷酸5-5-粘性末端序列。粘性末端序列。5 -CTCGAG- 3 5 -CTCGA- -G- 35 -CTCGAG- 3 5 -CTCGA- -G- 33 -GAGCTC- 5 3 -G- -AGCTC- 5 3 -GAGCTC- 5 3 -G- -AGCTC- 5 ABCCBAABNBAABBAABCCBAABNBAABBAB、平端、平端如：从流感噬血菌（如：从流感噬血菌（Haemophilus influenzae）分离出来的一种）分离出来的一种限制酶，其识别序列和切割位点为：限制酶，其识别序列和

6、切割位点为： 5 5-AAGCTT- 3-AAGCTT- 3 -5-A- -AGCTT-3 -5-A- -AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA- 5 -3-TTCGA- -A-5 A- 5 -3-TTCGA- -A-5 例限制酶例限制酶Hae III，它识别，它识别4核苷酸序列，切割点产生平口末端。核苷酸序列，切割点产生平口末端。 5 -CGCC- 3 5 -GG- -CC- 3 3 -CCGG- 5 3 -CC- -GG- 54. 限制性核酸内切酶的特异特点限制性核酸内切酶的特异特点 维持维持性甲基化酶：指新合成的维持维持性甲基化酶：指新合成的DNA链上的甲基化与模链上的甲基化与

7、模板板DNA链上的甲基化位置相同。链上的甲基化位置相同。构建性甲基化酶：该酶可在非甲基化的构建性甲基化酶：该酶可在非甲基化的DNA链上新甲基化。链上新甲基化。1（1）同裂酶）同裂酶 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。如：如：Hpa和和Msp，它们的识别序列均为，它们的识别序列均为CCGG，切割位，切割位点均为点均为CCGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏感性不同。在不含有甲基时，感性不同。在不含有甲基时，HpaHp

8、a和和MspMsp均可对其切割，均可对其切割，如果胞嘧啶被修饰为如果胞嘧啶被修饰为5-5-甲基胞嘧啶，则甲基胞嘧啶，则MspMsp可以切割它，而可以切割它，而HpaHpa就不能切割此序列。就不能切割此序列。 来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后DNA分子产分子产生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。 Sal 5 -GTCGAC- 3 5 -G- -TCGAG- 3 3 -CAGCTG- 5 3 -CAGCT -G- 5 和和Xho 5 -CTCGAG- 3 5 -C- -TCGAG- 3 3 -GAGCTC-

9、5 3 -GAGCT -C- 5两个粘性末端再连接后，产生两个粘性末端再连接后，产生 5 -GTCGAG- 3 3 -CAGCTC- 5 该该DNA既不能为既不能为Sal也不能为也不能为Xho所识别。所识别。6 6、限制性核酸内切酶识别序列的长度与识别位点的频率、限制性核酸内切酶识别序列的长度与识别位点的频率（1）第一个字母是酶来源物种的属名的第一个字母，且大写；）第一个字母是酶来源物种的属名的第一个字母，且大写；第二、三个字母是酶来源的种名的前两个字母，用小写。该第二、三个字母是酶来源的种名的前两个字母，用小写。该3个个字母是酶的名称；字母是酶的名称；（2）若有特殊的菌株，在）若有特殊的菌株

10、，在3个字母后加菌株号，用变种或品系个字母后加菌株号，用变种或品系的第一个字母，且大写；的第一个字母，且大写； （3）如果一种特殊寄主菌株分离出几个不同的限制修饰体系，）如果一种特殊寄主菌株分离出几个不同的限制修饰体系，按照发现和分离的顺序用罗马数字按照发现和分离的顺序用罗马数字、IIIIII表示。表示。 如从大肠杆菌（如从大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）R R株分离的第一种限制酶称株分离的第一种限制酶称为为EcoRIEcoRI 在在DNA 中，若中，若A、T、G、C四种核苷酸以相同频率出现，那么，一段四种核苷酸以相同频率出现，那么，一段DNA中，某

11、一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结合的位点的数量为中，某一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结合的位点的数量为1/4n (n为识别序列的长度为识别序列的长度)。 三、三、DNA聚合酶聚合酶能够催化能够催化DNA中相邻的中相邻的3-羟基和羟基和5-磷酸基末端之间形成磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键，磷酸二酯键， 1、T4DNA连接酶连接酶可连接带可连接带匹配粘末端匹配粘末端的的DNA分子，也可使平端的双链分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。分子相互连接。2 2、大肠杆菌、大肠杆菌DNA连接酶连接酶是基因工程中常用的一种酶，此酶在全酶时（分子量是基因工程中常用的一种酶，此酶在全酶时（分子量1

12、09000D）主要有）主要有3种酶活性：，种酶活性：，1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I只能连接带匹配粘末端的只能连接带匹配粘末端的DNA分子分子AATTC GG CTTAAAATTC GG CTTAA5 5 5 5 (1) (2)AATTC GG CTTAAAATTC G G CTTAA5 5 AATTC GG CTTAA5 5 (a)分子间连接(b)分子内连接(1) (2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶1、 53聚合酶活性：聚合酶活性： CCGGGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、53外切酶活性外切

13、酶活性 GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+ pC，pT3、35外切酶活性外切酶活性 TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg 2+TCGATAAGCTAT+ pC，pG，pC552、Klenow片段片段 DNA聚合酶聚合酶还可被枯草杆菌蛋白酶水解为还可被枯草杆菌蛋白酶水解为2个片段，其中个片段，其中的大片段（的大片段（Klenow片段，分子量片段，分子量76000D）具有）具有53聚聚合酶活性和合酶活性和35外切酶活性外切酶活性 四、逆转录酶四、逆转录酶 1、 53DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 2

14、、RNA酶酶H的活性，的活性，即即53和和35外切核糖核酸酶活性外切核糖核酸酶活性 ，但无，但无35脱氧核糖核酸酶活性，即无校对功能。脱氧核糖核酸酶活性，即无校对功能。 六、六、T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶 简称末端转移酶，它是从小牛胸腺中分离得到。该酶能将脱氧简称末端转移酶，它是从小牛胸腺中分离得到。该酶能将脱氧核苷酸逐个地加到核苷酸逐个地加到DNA分子的分子的3-羟基上，不需要模板。羟基上，不需要模板。4种种dNTPs中的任意一种都能作为它的前体物。中的任意一种都能作为它的前体物。当反应混合物中只有一种当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷时，就可以形成仅由一

15、种核苷酸组成的尾巴，我们特称这种尾巴为同聚物尾酸组成的尾巴，我们特称这种尾巴为同聚物尾。该酶可催化该酶可催化ATP的的磷酸转移到磷酸转移到DNA或或RNA5-OH末端。末端。 在杂交探针制备中，可用来标记在杂交探针制备中，可用来标记DNA片段的片段的5端；端；基因的化学合成中，使寡核苷酸片段基因的化学合成中，使寡核苷酸片段5磷酸化；磷酸化；DNA测序中，测序引物测序中，测序引物5磷酸标记。磷酸标记。用途：用途：八、八、S1核酸酶核酸酶 细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶作用：作用：可去除可去除DNA或或RNA5末端的磷酸末端的磷酸 。S1核酸酶主要功能是催化核酸酶主要

16、功能是催化RNARNA和单链和单链DNADNA分子降解为分子降解为55单核单核苷酸，同时也能作用于双链苷酸，同时也能作用于双链DNADNA分子的单链区，并从此切断分子的单链区，并从此切断DNADNA分子。分子。dNMPs，drNMPsZn 2+pH4.5Zn 2+pH4.51、核酸内切酶活性（同、核酸内切酶活性（同S1核酸酶）核酸酶）2、双链特异性外切酶活性、双链特异性外切酶活性用途：用途：（1）诱发）诱发DNA发生缺失突变发生缺失突变（2）定位测定）定位测定DNA片段中限制位点分布片段中限制位点分布（3）研究超盘旋）研究超盘旋DNA分子的二极结构分子的二极结构十、核酶十、核酶核酶不是蛋白质，

17、而是具有酶活性的核酶不是蛋白质，而是具有酶活性的RNA片段片段 。Ca2+一、化学合成法一、化学合成法1、基因片段的、基因片段的全化学合成全化学合成 2、基因片段的、基因片段的化学化学-酶促合成酶促合成二、基因的酶促合成（逆转录法）二、基因的酶促合成（逆转录法）mRNAcDNA逆转录酶逆转录酶图图1 基因的化学合成及克隆基因的化学合成及克隆图图2 基因的化学基因的化学-酶促合成酶促合成（一）（一）基因组文库的建立基因组文库的建立基因文库：指某一生物的全部基因的集合。基因文库：指某一生物的全部基因的集合。 基因组文库：指用全基因组基因组文库：指用全基因组DNA，通过几种限制性内切酶切，通过几种限

18、制性内切酶切割，所产生的基因组割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克隆，由此产生片段与载体重组并克隆，由此产生的克隆群体包含了基因组的克隆群体包含了基因组DNA的所有序列，称基因组文库。的所有序列，称基因组文库。 基因组文库的大小的估算：基因组文库的大小的估算：N=ln（1P）/ln（1f）N：为基因组文库必需的克隆数目。：为基因组文库必需的克隆数目。P：为文库中含目的基因：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率。片段的出现概率。f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。基因组大小基因组大小/bp2106（细菌）（细菌） 2107 （真菌）（真菌）

19、2109（动物）（动物）理论克隆数理论克隆数 实际克隆数实际克隆数 理论克隆数理论克隆数 实际克隆数实际克隆数 理论克隆数理论克隆数 实际克隆数实际克隆数 克隆片段克隆片段平均大小平均大小（bp）5103 400 1831 4000 18 418 600 000 2 763 11010103 200 919 2000 9208 300 000 1 381 55020103 100 458 1000 4603 150 000 690 77440103 50 278 500 2300 75 000 345 386 总总RNAmRNAtRNArRNAcDNA文库：指用一种生物的文库：指用一种生物的m

20、RNA经逆转录合成的互补经逆转录合成的互补DNA所建立的文库。所建立的文库。 （1）随机引物引导法随机引物引导法（2）oligo（dT）引导法）引导法 1、mRNA分离分离 （1）随机引物引导法）随机引物引导法（2）oligo（dT）引导法）引导法 35mRNAAAAAAATTTTTT35AAAAAATTTTTTKlenow酶酶mRNAcDNA第一条链第一条链355mRNAmRNA35Klenow酶、连接酶、酶、连接酶、3cDNA第一条链第一条链dNTPdNTP3、第二条链的合成、第二条链的合成（1）自身引导法）自身引导法（2）双链cDNA的置换合成（3）引物-衔接头法双链DNA的合成1、探针

21、的设计探针的设计根据根据DNAmRNA蛋白质的蛋白质的“中心法则中心法则” 2、切口平移技术制备切口平移技术制备DNA探针探针氨基端氨基端MetProGluGly羧基端。其中羧基端。其中Met只有只有AUG一个密码子，一个密码子，Pro有有4 个可能的密码子，个可能的密码子，Glu也有也有4 个可能的密码子，个可能的密码子，Gly有有2个可能的密码子。这些密码子个可能的密码子。这些密码子经随机排列，可能出现经随机排列，可能出现144232种可能的组合。种可能的组合。 5533 EcoR5533 3 5353 535355353535353535353 图图 DNA聚合酶聚合酶的切口平移的切口平

22、移五、利用转座子分离目的基因五、利用转座子分离目的基因 mRNA差别显示技术也叫差别显示技术也叫DDRT-PCR（differential display RT-PCR），即差异显示），即差异显示RT-PCR。 转座子（转座子（transponson）是一类带有完整复制系统和转位技能）是一类带有完整复制系统和转位技能的大片段的大片段DNA分子，它可以出入染色体，在整合到染色体上分子，它可以出入染色体，在整合到染色体上时，可影响到它两端基因的活性和表达，在从染色体上解离时，可影响到它两端基因的活性和表达，在从染色体上解离下来时，可带走部分下来时，可带走部分DNA片段或一个完整基因，因此转座子片段或一个完整基因，因此转座子又叫跳跃基因又叫跳跃基因 。1948年美国女遗传学家年美国女遗传学家McClintock 在玉米中首先发现的，在玉米中首先发现的，叫叫Ac/Ds系统。系统。 AcDsC座位C座位Acabcc-m突变转座子目前作为一种重要的标签（转座子目前作为一种重要的标签（tag）在基因组图谱中）在基因组图谱中有重要位置有重要位置 。亲本杂交亲