RNA原位杂交技术的重要性

1、RNA原位杂交技术的重要性个基ESfr么时间"卄么组织的表及储况，与研fiihgw的功fit密不可井.一粗检测基因左达水平的方法育Morihem印逝、RNase保护分析、FLNA就檯杂交和灵兄实时定塑PCR.RNA匪忡来空技术不哽时间和空间袤达的研究哽制，井结果没誠芭的有与无以及憔凶来农云农达的部位利强臥可以准确淸躺地反应基因表达的岸W*本硏究采用悝余交摂术*奋水稻茎尖分化前和付化睹殖个吋期来研究水辖开花谓捋网络中附幕因与仍咤的上卜窟调粹关杲.4.2O.TFL2与水稻开花葛因之间的调控关系AITFL2可以结含到的启动护绘转录区从B0抑制夷表达（Gtrnivuictal*2006；Ko

2、ukcTaa）2003：TaKadaSeial.i2003、Nakahig鸥hiKeiaL.2005?LiuCdal.2009：AdrianJei31.2（110；-此外”姒南芥中AlTFLi対开花過控何络中的诈農»因的丧达都能起到抑制作用"如噩円，AXCtMylnectar2006：Sungdal.2006=Finneyetal.t2007）然而住水稍开花调控网给中OtTFL2対开北相关竝囲的调控作用的研究未见报道，其是宵和在拟南芥中样起到相同的调控机理井未为人宿所知，需步謀入研宛"通过本硏究的RHA原位杂交佶果得知*GsLLlsGftrf?和E剧在CK和TFL

3、2RNA1两纽林料中的表达斌井未见有明显的芳舁.泊期这二者町能不QsTFL2的下潇¥因不«TFL：fiA接调控薛响；而可能是STFL2的下晞基囲找尖彷化前（27天）时GsTFL?对代CM起列卜调作用，城而押制JPCM的義达i另外，F皿在S8NCK比在ITURJJAi的衣达駅冇所变化，说阴凤/%受OsTFL2的囲控、隹于QsTFL2的下游，即在茎尖分化后TFL2可以促进H血的表达，从而起到MJT-lt-此结论也止和本实駙室之前研究的TFL2RNAi植殊推迟开花这一结果栩働音.通过半泄9RPPCR硏究莎析砒J屮HdSu在TFL2RNAJ肯吐下的表达就时扯现*蠱少化前和分化话H如

4、配唸到O$H7J星園创调控，并丸OsTFL2対H如的袁达具有促进的作用值得注意的是，本试归中半定aRT-PCR中所使用的模板为水稻叶子总RNA转录得到的总cDNA,而并非瘵个植株中的cDNA但OsTFL2足自接还定何按促进Hd3a的表达，或者是OsTFL2和英它开花堆因一超作用来上调Hdia的袤达，另外OsTFL抑制RCNI的表达的作用机理尊问国都有待进一步深入硏呢，从而掲示6TFL2在水稻开花调控网络中的定位.通过4研丸得知OsTFL2对Hd3a毎闵存在上卜游的关杀，M足怎么对Hd3a/&到促进作用的机理，只是在转录水平上的调控或宵足传录和转录后水平上都血调捋作用等间题述需耍深入探究

5、。在纵向匕可以通过GFP等阻合蛋白对水解中OsTFL2细胸定位.以及通过Westernbloting或耆输试验技术，来探討究竞是TFI2在转录水半还是在蛊白质水平上调控H如的表达：在横向上，利用染色质免疫沉淀技术<CHIP、凝胶阴滞试验或者DNaseI足泌法等技术，逬一步来雌STFL2是单独对Hdia起到调控作用还是（KTFL2和其它塞因或者蛍门囚子互作共同起作用，这些问腔均是对所要掲示的何题以及今真深入研究的方向.43应用RNA干扰技术研究水稻开花基因功能随若水稲基因组测序工作的完成及木稻cDNA库的不断完善，研究舌发现翘制拟南芥开花的大祁分基因在水稻基因组中都存在同源基因.用此，-般

6、采用反向遗传学和正向適传学于段来硏究水稻开花基凶功能.如反义、rna干扰和a&k达等反向逍传学技术来硏究开花调控基因在水稻中的功能，并参照拟南芥中的同源墓因功能比较分析；另外可以采用正向遗传学手段构建人规模的水稱冥变体库，并鉴定出与开花相关的究变体及母响开花时间的哭变基M，对于特昇性在空于水用中的幵花调控基因深入研究其功能。本研究是利舟反向遗传学中的RNAi技术一方面住lFL2RNAi梢株的背景卜硏究水稻种已经的开花基因的农达情况，来寻找OsTFJ.2下游调控的开花華内：另一方面是构建6MED32过表达与干扰表达载体，转入农杆苗中，通过农针菌弁导来侵染水稻兪伤，以方使后续工作得到OsM

7、ED320E和OsMED32RNAi的转呆因的植株，为深入对OsMED32在水稱中的功能研究捉供了医础.RNAi沉默效呆与dsRNA的給构、长度大小、是否帝有内含子以及在表达载体上的位買等因索祁相关，特别是发*式结构RNA(hpRNA)能大大提KRNA沉默效率(WisleySetal.,2011).在植初中dsRNA的氏度大小为500bp左冇，此时的尸扰效果较好(Hanunohd$M曰al.,2000).hpRNA我体设计思珞是将妄沉欧的把華因的一段序列反向朿复连接在启动子和终止子之间.共表达的RNA形成hpRNA结构。hpRNA结构的正反向重复序列之间需包括一段内含了，形成带有内含子结构的h

8、pRNA妙体，此时其沉狀效率可从50%提禺至90%甚至是100%(HamiltonAFefal.1999；LinJHetal.r1998；SmithNActal.,2000).A：研究设计的RNAi片段忙度为3&0bp左右，夭小适屮并且便用本实验保存的P17劇卡扰载体作为中间载体，使OsMED32RNAi360bp片段在pl76幵扰载体连接两次，使其反向互补结构而形成hpRNA,且根p!76#f扰較体本身的彤列特点，在两段OsMED32RNAi片段之间，l320bp长段作为内含子序列，构建成带内含子的发兴式结构RNAi植物表达载体.这样大大提高了沉默效率.|在构建载体时表达载体的大小同

9、杆影响封遗传转化效聿，而本研兇中使用的表达裁体pC'AMBlAJ300是带有35S启动于和NOS终it子，直人小约为lOOOObp,其人小适中，不会彫咱转化效率.4,5OsTFL2DNA和cDNA序列的保守性与趋异性(HTFL2DINA和cDNA序列的保守性关和新等研究发现植物TFL2蛋“质的N末瑞具仃保寸序列(Motif),其中包播K/R和E/D类的Motif:另爪研究表明植物TFL2同源蛋白质序列祖NLS3及CSD区具有髙保守性.本研究发现在不同水稻中，虽然粳稻的进化速度虽快，但是内含子仍然存在于野生稻DNA序列中，这一结契我们得知I,不同水稻品TFL2DNA的序列同样具有保守性.

10、0$TFL2DNA和cDNA序列的越异性关和新等提出了大寿TFL2(包括MITFL2)的进化主要源于序列的插入和缺失(Guanetal.,2011)。同样本研究发现，水稻中同样存在类似的情况.如JTNBTFL2DNA缺失“GAG”三个碱耳(编码氨基敲“E”)，而2616TFL2外显子上则插入“GAG”三个緘堆.这一结果也为关和新等提岀的“播入和缺失”机理提供了新的匹据.水稻不同品种间的序列比对分析得知序列的高保孑性不尊同于性状的商保守性，即在水稻中，6TFL2级络构水平上具有高的保守性；然而，该星因在木稻植林性状的表现性具侑省异性。Ed)Motif介导的不等交换叮以引起彳、冋物神TFL2N木端

11、和对疋侵发生严車分歧(Cuanrtd.,2011).本研究中不同水稻品#DNAJCDSZn)的分歧，推测是在细胞滅数分裂时发生的不等交换以及RNA加工£除内含子这两个过程是OsTFL2堆因变井的主要来源。在自然群体TFL2的DNA序列具有多样件，但是通过对不同水稻品种斥列的分歧，很大可能是由于木稻是裁培群体，貝名畀性会根捱人类的栽培需賛而改变.内含子都存任F粳稻58N和利I梢中.这一結果揭示OsTFI.2RXA加丁和功能衷现型受到遗传背景的讷抻.另外，英煜松O9TFL2转基因统计结果显示，2615TFL2RNA1转堆因并未像58NTFL2RNAi一样延迟水稻开花,即匸尺1«

12、2在58>4中对开花克到促迸作用,而在2616中TFL2对开花并未有明显的促进或推迟作用(叢煌松，2012年硕士论文人结合木研究屮水豁岳种DNA和CDS序列的坦斤性这一纳果，我们推测不同水稻品种有不同的开花机理，OsTFL2促进开花囚£种的不同而存在花别.4.6MED£白在植物中的调控作用调停贵白復合物枠次从酵母中提纯(KimciaL,14).圈后的研究发现诚绰蛋片货合物是宾核生物中转录过程所必需的(Bourbon,2008).直到最近从拟南芥中的研究中还实了植物屮调停蛋白贷合埸的厅在(Backstrometal.,2007)研宪发现SWP1EEDI4通过组31白去乙

13、服化HDA19而与转录共遏制丙子LEUN1G相可作用(Gonzalezetal.,2007).值得注总的是.许多堆因涉及染色体修饰和结构重津而影响开花与植物的防御(WagnerandMeyerowtz,2002：HeandAmasino,2005：Zhouetal.2005：Walleye(al,*2008：March-Diazetal.2008：Wuetal.>2008).从现何的MLD覆白功能的研究结果.我们得知MED蛋白在植物开花型控中起到車要的作用，至于肿32的功能研究冃前未见报道。寥于水稻中岡>32是单拷贝，且MED14和MED32都是调停蛋白复介物的尾部"我们

14、推*6MED32可施与水稻开花调控存在某种关系，另外CHMED32可能作为谀控因了参与67712调控开花过程。为了证实这一点，首先我们耍构OSMED32OE和OsMEDI2RNAi的衣达载体，通过农杆菌介导何化至水稻愈伤中从而得到MFD32OE和MED32RNA1转基因柿株。至TOSMED32的功能、足否像临DW样通诃染色体上组蛋门去乙酰化来调节开花基因的表达.与OSTFL2足否存在调控关系以及与水稻开花存在调控的关系，还需耍深入研究.車冊究通过RXA原位杂交利半定旦RT-PCR.方法，在TFL2RNA1背最卜'对和RCN1等开花基闵的表达量进行分析得知：和Hd3u是0丁FL2的下游搖因，其两者表达灵受到OSTFL2调払而0$讥】、G3和£Ji川在CK和TFL2RNAi两給扌才料中的表达辰并未见有明呈的幷异，说明这三者可能不是OsTFL2的下游幕囚不"TFL2的頁接调控影响.另孙，通过对水稻的不同品种序列分析符知，不岡水稻品种TI；L2DNA的斥列同样具有保守性.HOSTFL2序处的侖保方性并不等同于性状的高保守性；在水稻中同样存在像Guanhexin捉出序列的“插入和缺失”机理类似的怖况序列的插入和缺失，加之不同水耕品种DNA和CDS之间的分歧，加测在细胞减敷分裂时发生的不等交换以及RNA加工去除内含这脚个过程&OsTFL