分子荧光光谱分析

1、关于分子荧光光谱分析现在学习的是第一页，共22页光致发光光致发光（PhotoluminescencePhotoluminescence）: : 荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象回基态时的发光现象. . 荧光荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最：受光激发的分子从第一激发单重态的最 低振动能级回到基态所发出的辐射。低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到从第一激发三重态的最低振动能级回到 基态所发出的辐射。基态所发出的辐射。现在学习的是第二页，共22页分子的多重态分子的多重态单重态单重态

2、一个所有电子自旋都配对的分子的电子一个所有电子自旋都配对的分子的电子 状态。大多数有机物分子的基态是单重态。状态。大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能当基态一对电子中的一个被激发到较高能 级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于 单重态。单重态。三重态三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。激发三重态能量较激发单重态低。现在学习的是第三页，共22页现在学习的是第四页，共22页一、分子退激发的过程一、分子退激发的过程激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途

3、径占优势。激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占优势。1、振动驰豫、振动驰豫 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个 振动能级振动能级 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最 低振动能级低振动能级 需时间需时间10-1310-11sec，效率较高，效率较高2、荧光发射、荧光发射现在学习的是第五页，共22页 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到基态基态荧光发射。荧光发射。 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种现荧光光谱的波长比吸收光的波长大（

4、长），这种现象叫作象叫作红移或斯托克斯位移。红移或斯托克斯位移。3、内部转换、内部转换 1）分子内过程，热退激）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸收）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸收1、 2 两种波长的光后，都产生两种波长的光后，都产生 2 的荧光。的荧光。4、外转换、外转换 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量转换。转换。现在学习的是第六页，共22页5、能系间交叉跃迁、能系间交叉跃迁 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化6、磷光、磷光从三重态最低振动能级回到基态，放出磷

5、光。从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。二、影响荧光强度的因素二、影响荧光强度的因素1、荧光效率（、荧光效率（荧光量子产率荧光量子产率）物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：）表示：现在学习的是第七页，共22页现在学习的是第八页，共22页吸收的光子数吸收的光子数发射的光子数发射的光子数激发态的分子数激发态的分子数发射荧光的分子数发射荧光的分子数=Fff f与退激发过程的速率常数与退激发过程的速率常数k k有关有关icececiffkkkkk+ + + +=Ff 凡是使荧光速率常数凡是使荧光速率常数k kf f增大而使其他退激发过程（能增大而使其

6、他退激发过程（能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的因素都可系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的因素都可使荧光增强。使荧光增强。K Kf f、K Ki i与分子结构有关，与分子结构有关，K Kecec、K Kicic与分子所处的环境与分子所处的环境有关有关现在学习的是第九页，共22页高荧光分子高荧光分子f 1 1，无荧光分子，无荧光分子f 0 02 2、影响荧光强度的因素、影响荧光强度的因素 1 1）荧光与分子结构的关系）荧光与分子结构的关系 a a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚性、平、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、面、多环结构，

7、而且共轭平面越大、电子共轭度越大，电子共轭度越大， f越高。越高。 b b、取代基的影响、取代基的影响 给电子基团使给电子基团使f增强，如增强，如-NH-NH2 2、-OH-OH 与与电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小现在学习的是第十页，共22页 高原子序数的原子引入高原子序数的原子引入电子体系，使荧光减弱电子体系，使荧光减弱 吸电子基团，如：吸电子基团，如：-COOH -COOH 、NONO2 2 、N=ON=O2 2、 卤素卤素使荧光熄灭。使荧光熄灭。 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以减少分子刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以减少分子

8、振动，减少能系交叉和碰撞退激。振动，减少能系交叉和碰撞退激。 2 2）温度和溶剂效应）温度和溶剂效应 温度升高，温度升高， f下降下降 溶液黏度下降，溶液黏度下降， f下降下降 不能使用含有重原子的溶剂不能使用含有重原子的溶剂现在学习的是第十一页，共22页 溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。长改变。现在学习的是第十二页，共22页 3）pH值的影响值的影响 荧光物质的电离与非电离形式的荧光

9、物质的电离与非电离形式的f有差别，有差别，带有酸性带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pHpH关；关； 4）溶解氧的影响）溶解氧的影响 溶解氧的存在使溶解氧的存在使f下降下降现在学习的是第十三页，共22页第二节第二节 荧光分光光度计荧光分光光度计一、基本构造一、基本构造 1 1、光源、光源 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。 2 2、单色器、单色器 两个，互成直角两个，互成直角 3 3、样品池、样品池 四通杯四通杯 4 4、检测器、检测器 光电倍增管光电倍增管现在学习的是第十四页，共22页二、仪器光路二、

10、仪器光路光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发射单色器发射单色器检测器检测器现在学习的是第十五页，共22页第三节第三节 荧光光谱法的基本参数及测量荧光光谱法的基本参数及测量一、荧光强度一、荧光强度根据朗伯根据朗伯- -比尔定律比尔定律Ia=IIa=I0 0-I=I-I=I0 0(1-10(1-10-bc-bc) ) 则则I If f=f fI I0 0（1-101-10-kbc-kbc)=I)=I0 0(1-e(1-e-2.303k=bc-2.303k=bc) ) 对于稀溶液，对于稀溶液，kbc=A A0.05 I If f= 2.303 = 2.303 f f I I0 0 kbkbc

11、c当当I I0 0一定并且浓度一定并且浓度C C很小时很小时, ,荧光强度与荧光物质浓度成正比荧光强度与荧光物质浓度成正比 I If f= KC K = 2.303 I= KC K = 2.303 I0 0 kb)kb)现在学习的是第十六页，共22页Cmax0.05/kb当当C超过超过Cmax 时，时，IfC偏离线性偏离线性溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分子之间溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。荧光自熄灭：荧光自熄灭：C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭

12、现象荧光自吸收：荧光自吸收：荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收现在学习的是第十七页，共22页二、激发光谱与发射光谱二、激发光谱与发射光谱激发光谱激发光谱:固定发射波长固定发射波长(EM),一般在最大发射位置一般在最大发射位置 做做If EX的光谱，既不同波长激发光所的光谱，既不同波长激发光所 产生荧光的相对效率。产生荧光的相对效率。发射光谱发射光谱:固定激发波长固定激发波长(Ex),一般在最大吸收位置一般在最大吸收位置 做做If EM的光谱，既最大吸收波长下产的光谱，既最大吸收波长下产 生荧光的相对强度。生荧光的相对强度。目的目的:找到找到EX

13、max 和和EMmax现在学习的是第十八页，共22页三、荧光分析法三、荧光分析法直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强 度，按吸收定律计算样品浓度。度，按吸收定律计算样品浓度。间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强 荧光物质）间接测定。荧光物质）间接测定。 探测剂称为荧光探针探测剂称为荧光探针样品浓度的定量计算采用标准曲线法样品浓度的定量计算采用标准曲线法现在学习的是第十九页，共22页四、荧光分析法的应用四、荧光分析法的应用无机物分析无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光无机离子中除少数例外一般不发荧光. .但很多无机但很多无机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物离子能与一些有机试剂形成荧光络合物, ,而进行定量测定而进行定量测定. .生物化学及生理医学方面的应用生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重要的化荧光法对于生物中许多重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性合物具有很多的灵敏度和较好的物效性, ,故广用于生物化学分析故广用于生物化学分析, ,生理医学和临床分析生理医学和临床分析. .药物分析药物分析荧光分光光度计作为高效液相色谱荧光分光光度计作为高效