综述细菌原生质体融合进展

1、综述细菌原生质体融合进展 冯丹 10级 杏坛生工 202112401007摘要：原生质体融合技术由于可以在种间、属间及科之间构建出新型菌株，已成为一项公认的快速组装新物种，尤其是微生物新物种的基因工程技术。在细菌、酵母菌、真菌等遗传育种方面被广泛应用。文中综述并举例说明原生质体的制备与再生技术与影响因素、原生质体形成率及原生质体融合条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的开展前景。关键词：原生质体融合；原生质体制备；融合条件；融合子 细菌原生质体融合(bacterial protoplast fusion)是20世纪70年代开展起来的重要基因重组技术。

2、1976年FODORK等【l】采用聚乙二醇(PEG)、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌(Bacillusmegateriutrb原生质体的融合，SCHAEFFER P等【2】翻报道了用PEG诱导枯草芽孢杆菌(Bsubtillis)的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术开展的里程碑。细菌原生质体融合育种技术不但可以改进菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。1细菌原生质体制备和再生11细菌原生质体制备制备细菌原生质体，是进行原生质体融合的前提和根底，不同细菌细胞壁组成各不

3、相同，所以制备原生质体最正确条件也存在着很大差异。在制备细菌原生质体时，曾采用过机械法脱壁，但原生质体制备数量有限而且容易使原生质体受到损伤，不利于再生。目前主要使用酶法脱壁，绝大多数细菌使用溶菌酶作为工具酶，但也有例外，YOSHINO S等旧制备糖丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)原生质体时，除使用溶菌酶外，还使用了N乙酰胞壁酸L丙氨酸酰胺酶；张莉滟等【3】制备长双歧杆菌(Bifidobactefium longum)原生质体时，使用5mgL的变溶菌素(Mutanolysil进行菌体脱壁。而且使用的最适溶菌酶浓度为01mgml_2Om

4、gmL。12细菌原生质体再生酶解脱壁后的原生质体应该具有再生能力，这是原生质体融合育种的必要条件。细菌原生质体再生包括壁再生、功能修复、分裂和萌发这些相互联系而又具有一定独立性的生理过程。尽管原生质体具有生物活性，但它不是正常细胞，在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身特性、原生质体制备条件、再生条件和操作方式等，尤其是原生质体制备时酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大，酶浓度过大、酶解时间过长那么再生率降低。对数生长期细菌在原生质体再生过程中能明显提高再生率。(1) 原生质体形成率P=经酶处理后形成的原生质体数未经酶处理的总菌落数*100%(2) 原

5、生质体再生率Rp =(能再生的原生质体数经酶处理后形成的原生质体数)*100%1.21以苏云芽孢杆菌为例论述影响原生质体形成率与再生率的因素青霉素对原生质体形成率(P)的影响裹1 青霉素浓度对破璧效果的影响青霉素浓度u*ml-1 1*(%) 2*% 00.40.81.21.62.02.42846504742403630586765575048裹2 青霉素参加时间对破壁效果的影响参加时间h 1*(%) 2*% 12345600434650410056636759注：1、 时间从菌种接人培养基算起2、因青霉素的抑制，菌体未生长。由表1，表2的结果可知，青霉紊对Bt的原生质体形成有明显的促进作用，且

6、参加时间以5 h时为好。此时刚刚进入对数期，细胞处于生长繁殖最旺盛的时期，大量细胞壁物质被合成，这时参加青霉素可在对数期后期获得大量的细胞壁有缺陷但仍具活力的细胞，增加了苗体对溶菌酶的敏感性，可获得较高的原生质体形成率。由结果可知，青霉素浓度以08 umL，参加时间以5 h时为最正确。【4】22 菌龄对原生质体形成率P)及再生率(Rp )的影响表3 菌龄对原生质体形成率P )及再生率( Rp)的影响菌龄1*P%1*(Rp)%2*(P)%2*(Rp)%对数期前期6h64107512对数期中后期10h60137215稳定期13h222248表3显示1 ，2 的对数期菌体比稳定期的易于破壁，这是因为

7、稳定期产生大量芽孢，其胞壁结构要比营养体结实，也较复杂，因此释放原生质体较困难。我们选择对数期中后期的菌体来制备原生质体，是因为这一时期的原生质体再生率高。1.22再生培养基是原生质体进行再生的最重要外界因素之一。细菌再生培养基中常补加2类物质，一类是水解酪蛋白、血清血蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等营养因子；另一类是渗透压稳定剂，包括KC1、NaC1、CaC12、MgCh等无机物质和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸钠等有机物质。OKAMOTO T等【5】研究乳链球菌(Streptococcus lactis)原生质体再生时发现Ca2+、M 的存在可以显著提高原生质体的再生率，Ca、M 对维持原生质

8、体稳定性具有一定作用。1.23细菌原生质体再生时的培养方式也会对再生率产生影响。固体培养法比液体培养法明显有利于细菌原生质体再生，并且双层平板法培养的再生率高于单层平板培养的再生率。再生培养基上的菌体密度也不能过高，否那么先长出的菌落会覆盖后生长的菌落，一般认为原生质体数量级在10s时，再生平板上的原生质体才能呈现良好的别离状态【6】1.24细菌原生质体制备时，还受其他因素的影响。如酶解pH值一般为75左右；酶解时间从20min-10h都有报道；酶解温度多采用3537或42；同无机渗透压稳定剂相比，05molL蔗糖或05molL甘露醇作渗透压稳定剂制备率更高；另外，菌体预处理、鳌合剂的使用、培

9、养方式等都会影响细菌原生质体制备率。2.亲本菌株的选择进行细菌原生质体融合的最终目的就是要获得遗传稳定的融合子，合理的亲本菌株的选择性遗传标记是筛选融合子的前提，是细菌原生质体融合技术得以应用的关键。在细菌原生质体融合过程中，营养缺陷型标记【7】、抗药性标记【8】、荧光染色标记【9】、灭活标记【10】、形态标记【11】等被经常采用。3. 细菌原生质体融合技术细菌原生质体融合技术是亲株细胞被酶解脱壁形成原生质体后，在高渗条件下混合并参加化学或物理助融条件，使双亲株原生质体相互凝集，通过质融合、核融合、基因组间的交换、重组，进而在适宜条件下再生出细菌细胞壁、获得重组子的过程。31诱导融合的方式原生

10、质体融合研究早期曾用过离心方法，使原生质体紧密接触或在冷的渗透稳定液中凝集融合。目前除经常使用的化学融合剂聚乙二醇【12】外，电场诱导与激光诱导方法【13】也被广泛地应用。32原生质体融合及融合子的检出参照梁平颜等【14】的方法进行,融合频率F=融合平板菌落数-双亲存活菌落数双亲株原生质体总数*100%融合子的检出：在原代融合平板上参加2种抗生素，可以保证生长的菌或者是形成杂合双倍体或单倍重组体的真正融合，或者是形成异核体的暂时融合，因此，对这些菌在进行连续传代10 次后，不回复的可以认为是真正的融合子。参考文献：1FODOR K，ALFOLDI LFuon of protoplasts of

11、 Bacillus megateriumJProcNaAcad SciUSA，1976，73(6)：214721502SCHAEFFER P，CAMI B，HOTCHKISS R DFusion ofbacterial protoplastsJ】Proc Natl Acad Sci US 1976，73(6)：215 1-21553张莉滟，黄勇，张德纯双歧杆菌原生质体的制备与回复研究【J】微生物学杂志，2004，24(2)：24-26。4 10陈五岭张芳琳 景建洲 孙连魁等灭活原生质体融合技术选育苏云金杆菌新菌种5OKAMOTO FUJITA Y，IRIE R Protoplast forma

12、tion and regenerationofStreptococcuslactis cellsJ，AgricBoilChem，1983，47(2)：259-2636 8金玉娟，刘自镕，任建平芽孢杆菌和欧文氏菌的原生质体融合的研究 微生物学杂志，2002，22G)：10117DAI M H，ZIESMAN S，RATCLIFFE T，et a1Visualization ofprotoplastfusion and quantitation ofrecombination in fused protoplasts ofauxotrophic strains ofEscherichia coli

13、JMetab Eng，2005，7(1)：5-529黎永学，张德纯，李代昆双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探讨J食品科学，2006，27(2)：848611CHEN OHMIYA K SHIMIZU S Intergeneric protoplast fusion bet-weellFusobacteum vanum an dEnterococcusfaecium forenhancingdehydrodivanillin degradationJAppl Environ Mierobiol，1 987，53(3)：54254812KAOKN，MICHAYLUKM RA method for High-frequency intergenericfusion ofplantprotoplastsJ，Planta，1974，