CDDST癌症化疗药物敏感实验项目北京维达健医药科技发展有限公司培训讲义

1、1CD-DST胶滴肿瘤药敏检测技术小林昶运（Kobayashi H）博士CD-DST（癌症化疗药物敏感实验癌症化疗药物敏感实验）2 肿瘤个体化化疗简介 肿瘤药敏实验发展历程 肿瘤药敏实验方法分类 CD-DST检测介绍 CD-DST法实验流程3肿瘤个体化化疗简介肿瘤个体化化疗简介4一、肿瘤个体化化疗简介2022-3-224资料显示：我国恶性肿瘤年发病例数为资料显示：我国恶性肿瘤年发病例数为200万，死亡约万，死亡约150万，并以万，并以3的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率之最的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率之最5 肿瘤治疗的三大手段 手术治疗：局部治疗 放射治疗（简称放疗）

2、：局部治疗 化学药物治疗（简称化疗）： 全身性治疗，近100种2022-3-225化疗药物：主要作用是阻止癌细胞增殖、浸润、转移直到最终杀灭癌组织。目前所使用的绝大多数化疗药物，主要是利用药物抑制细胞增殖和肿瘤生长效应发挥抗癌作用细胞毒作用（化疗药物副作用的根源）6长期以来，由于无法在治疗前判断不同肿瘤个体对药物的敏感性和耐药性，临床医生主要根据经验对患者进行治疗，具有相对的盲区。（培养成功率低、临床符合率低等）不正确的治疗不仅使患者遭受痛苦，身体状态严重受损，同时可诱导肿瘤细胞产生对多种药物的联合耐药，导致化疗失败（细胞毒作用）。因此，临床需要能在化疗前为患者筛选敏感性药物的检测技术，客观的

3、针对不同个体选择和优化化疗药物（组合），实现肿瘤病人的个体化治疗。2022-3-22677 个体化治疗（最适宜药物疗法）-药敏试验 目前代表性体外药敏实验：MTT 、ATP-TCA、HDRA。不同程度地部分解决肿瘤个体化治疗的问题，但均存在所需细胞数量多，不能解决小量标本进行药敏检测的问题。 CD-DST技术克服了其它方法的缺点：所需细胞数量少、敏感、快速、临床相关性好（日本临床广泛应用）2022-3-2278 由于遗传背景的差异, 患者对化疗的反应各不相同：有的患者经化疗后可达到完全缓解, 有的却表现为无效甚至病情进展 不同种类的肿瘤, 对抗癌药物的敏感性不同, 即使同一种类型的肿瘤（临床分

4、期、病理类型、患者基本状态相同）, 不同的患者对药物的敏感性及预后也不相同。 必须化疗药物个体化2022-3-2289 各种肿瘤常见化疗方案 各种肿瘤癌症化疗方案-20130503.docx2022-3-2210药敏试验发展历程1953年，Blank和Speer提出了“化疗(Chemotherapy)”的理念1969年，Cline提出了理想的药敏实验方法应该具备的特点：简单、快速、敏感、可筛选不同药物、与临床有良好相关性1978年，Bogden将裸鼠肾包膜下人类癌模型应用于化疗药敏实验（SRCA）1983年，Mosmann采用四氮唑盐比色法（MTT）进行药敏实验1988年，Scvin等将三磷酸

5、腺苷-生物荧光肿瘤药敏检测技术（ATP-TCA）应用于卵巢癌肿瘤药物敏感性检测1997年，小林昶运（Kobayashi H）提出CD-DST技术，并指导医生对患者进行个体化治疗。11肿瘤药敏试验方法分类12按照培养方法的不同分类肿瘤单细胞培养：单层培养法，HTCA(人肿瘤细胞集落测定)HDRA (立体微小组织块细胞培养法)SRCA (肾包膜下移植药敏检测)CD-DST（胶滴肿瘤药敏检测技术）MTT(四氮唑化合物)法ATP-TCA法DISC法(区别染色细胞毒检测)荧光细胞印记分析法FCM法(流式细胞术) 中性红染色法按照测定原理的按照测定原理的不同分类不同分类13一、单层培养法获得肿瘤标本，制成

6、单细胞悬液后，加入不同浓度的化疗药，检测细胞的存活量得出药敏试验结论。特点：方法简单、实用失去了体内的三维结构药物接触浓度与体内不同人肝癌细胞14二、HTCA法(人肿瘤细胞集落测定法)将肿瘤细胞分别暴露于各种抗癌药物，再接种到软琼脂上，经过4-6周，肿瘤细胞将增殖并最终长成集落，对照集落形成数量的比较，从而分析受试药物的抗增值效应。特点：几乎适用于所有类型的肿瘤实验周期长（4-6 周）费时费力，主观性强骨髓瘤细胞集落神经母细胞瘤集落15三、HDRA(微小组织块培养药敏实验)在胶原上培养微小肿瘤组织块（1 mm3），加入化疗药物后，观察组织块对化疗药物的敏感性。特点：更接近机体实体瘤环境方法繁琐

7、MTT处理后16四、 SRCA法(肾包膜下移植药敏检测)在裸鼠肾包膜下接种人类肿瘤组织，肿瘤形成后，将化疗药物注入裸鼠腹腔进行化疗药物实验，通过测量肿块两顶端直径，比较肿瘤体积改变，评估化疗药物效果。特点：保持肿瘤原有的生物学特性能客观反映化疗药物敏感程度实验动物要求高，价格昂贵操作过程较复杂、接种成功率低GFP标记的肿瘤细胞17五、CD-DST法(胶滴肿瘤药敏检测)将肿瘤细胞包埋于胶原凝胶滴中进行立体培养, 使其在接近人体生理状态的环境中对抗癌药物的敏感性进行定量分析。特点：原代肿瘤细胞培养成功率高少量标本即可进行试验抗癌药物效果与临床匹配度很高18名称2D/3D培养细胞/组织培养结果判断标

8、准单层培养法2D细胞形态学的改变或同位素前提的掺入量多少HTCA法(人肿瘤细胞集落测定法)2D细胞集落形成数量HDRA(微小组织块培养药敏实验)3D组织测定活细胞数SRCA法(肾包膜下移植药敏检测)3D组织测量肿瘤块两顶端直径CD-DST法(胶滴肿瘤药敏检测)3D细胞测定活细胞数19名称检测物质颜色特点MTT(四氮唑化合物)法甲臜紫色方法简便，细胞量大ATP-TCA法ATP荧光检测效率高、体内体外符合率较高、自动化程度较高、间质细胞干扰较大DISC法（区别染色细胞毒检测法）坚固绿或坚固绿-苯胺黑染料亮绿色不需要单细胞悬液、不依赖细胞的分裂，仅应用于血液系统标本荧光细胞印迹分析法荧光素荧光测试范

9、围广，荧光易淬灭FCM法（流式细胞术）FDA(乙酰乙酸荧光素)或PI(碘化丙啶)或荧光药物含量等荧光所需细胞数量少；测量的参数多，仪器昂贵、技术需求高中性红染色法活细胞红色操作简便，费用较低，结合成像系统可定量分析20目前体外抗癌药物敏感性试验的问题点原代培养成功率及试验成功率低很难做到体外三维共培养，不能良好模拟体内环境药物接触浓度高真阳性率低（药敏试验判断为敏感的抗癌药物实际临床效果不显著）无法区分混在一起的成纤维细胞和癌细胞数据偏差大多数方法缺乏临床验证数据多数方法质控不严谨21CD-DST法实验流程22DAY 1DAY 2DAY 3DAY 9技术流程图23一、肿瘤组织标本采集数枚大小为1cm3的活性较高的标本此实验所需手术标本的量：肺癌、大肠癌等固体癌需要0.5-1.0g间质较多的乳腺癌、胃癌、大肠癌等需1.0-3.0g24二、分散肿瘤细胞将肿瘤组织分散成小的细胞团切碎的肿瘤组织分散的肿瘤细胞25三、胶原凝胶包被培养瓶预培养促进肿瘤细胞生长，清除血细胞、死细胞及非细胞杂质等26四、胶原凝胶滴培养癌细胞可在胶滴培养基内良好地增殖，体现出与活体内相同的生物形态及活性。27五、抗癌药物接触 药物浓度数据为长期实验研究获得，与临床用药效果相符。28六、无血清培养 药物清洗后，需继续培养5-7天，再检测药物抗癌效果。PCM2培养基培养5-7天29