肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展 论文

1、肿瘤细胞多药耐药基因及产物肿瘤细胞多药耐药基因及产物 p p 糖蛋白检测方法的糖蛋白检测方法的研究进展研究进展 论文论文关键字：方法 表达 耐药 基因 细胞 化疗 结果 检测 免疫摘要: 肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药（MDR）是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。肿瘤细胞的多药耐药有多种类型。本文对 Mdr1 基因及 P 糖蛋白（pgp）的生物学特性及检测方法作一综述。目前，化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗方案的改进及新药的使用，临床化疗效果越来越好，但仍然发现一些患者在化疗前后对某些药物产生耐药性，从而影响化疗效果。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐

2、药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时，对其结构和作用机制无关的化疗药物产生交叉耐药。多药耐药的类型有多种。如 Mdr1 及其产物 pgp 的表达增高，多药耐药相关蛋白基因的扩增或表达增加，DNA 拓朴异构酶活性增高或性质发生改变，谷胱甘肽解毒系统酶活性增高等。本文就 Mdr1 和 pgp 的生物学特性及检测方法作一综述。1 多药耐药基因 1（Mdr1）和 P 糖蛋白（pgp）的生物学特性1.1 Mdr1 MDR 基因在人类有二种 Mdr1 和 Mdr2，其中 Mdr1 与肿瘤的多药耐药有关。Mdr2 的功能尚不清楚，但 Mdr1 和 Mdr2 基因序列具有较高的同源性。人类 Mdr1 基因位

3、于第 7 号染色体长臂上，含有 28 个外显子，内含子与外显子交界符合经典的 A/G 规则，全长为 4.5Kb，含有一个开放读框，编码 1280 个氨基酸多肽，经糖基化后形成 170KD 的 pgp1。目前对 Mdr1 基因的表达调控还处于研究之中。研究表明抗肿瘤药物、致癌剂、紫外线、热应激等都可使 Mdr1基因活化，ras、raf、p53 等癌基因也参与 Mdr1 基因的表达调控2，3。有人发现，在原发性乳腺癌患者中，Mdr1 基因的转录受 Y 盒转录因子（YB-1）的调节，而且 YB-1 的位置与 Mdr1 基因表达密切相关，在对药物敏感的乳腺癌细胞株 MCF-7 中，YB-1 位于胞浆中

4、，而在耐药细胞株 MCF-7 中，YB-1 位于细胞核中，因此认为 YB-1 也参与 Mdr1 基因的调控4。1.2 pgp pgp 是由 Mdr1 基因编码、其分子量为 170KD、由 1280 个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由两个同源部分组成，两部分之间的同源性大约为 48%，每一部分约含有 6 个疏水跨膜区和一个 ATP 结合位点，通过 ATP 供给能量，将亲脂性药物泵出细胞外。在正常人体的肾上腺、肾、肝、结肠、胰及脑毛细血管内皮细胞中均有 Mdr1 pgp 的表达，其生理功能为将细胞内的毒性代谢产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。在脑组织中，Mdr1 pgp 对维持血脑屏障起重要作用，它可

5、将内皮细胞中的异物（物药、致癌物等）排列毛细血管腔而保护脑组织。在正常人体的造血干细胞，T、B 淋巴细胞，NK 细胞上都有 pgp 表达，其生理功能仍不清楚，但研究表明 pgp 参与人体外周血 T 淋巴细胞中的细胞因子（如 IL-2，IL-4，-IFN）的输送5，6。Mdr1 被克隆并发现在某些正常组织中表达后，人们就开始对肿瘤组织中的 Mdr1 进行分析。在肿瘤细胞中，pgp 通过 ATP 供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素 D 等药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞耐药。2 Mdr1 和 pgp 的检测方法Mdr1 和 pgp 的检测方法主要有两类，一类是蛋白质定法，包括免疫组化法、免疫印迹法和

6、流式细胞仪检测法等。一类是 mRNA 测定法，包括 Northenblot、Slot blot、RNA 原位杂交法及 RT-PCR 检测法。2.1 免疫组化法 常用的方法是免疫组化 ABC 法。冰冻切片常规处理后，与抗 pgp 的单克隆抗体孵育，然后加入生物素标记的二抗孵育，再加亲合素-过氧化酶复合物孵育、洗片，最后用含 0.03%-0.05%过氧化氢的 DAB 液显色分析结果。免疫组化法是较传统的检测方法，由于其操作简便，不需要贵重仪器，且可分析肿瘤细胞的异质性，因此是目前国内外常用的检测方法。由于其特异性和敏感性较低，且需要冰冻组织切片，因此 1994 年 karoly 等对此方法进行了改

7、进，创建了一种新的“免疫组织化学夹心染色法（LPS）”，此方法直接用福尔马林固定的组织细胞，经石腊包理、切片、过氧化氢处理后，与抗 pgp 的单克隆抗体 JSB-1 孵育后有序地加三层过氧化物酶标记的第二抗体第一层为过氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG f(ab)2，第二层为鼠单克隆过氧化酶 抗过氧化酶复合物，第三层为过氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG f(ab)2的孵育、洗片、染色、分析结果。LPS 法直接取组织细胞固定，不需使用冰冻切片，且因增加了三层过氧化物酶标记的第二抗体，使免疫染色密度增加，结果更清晰。由于 JSB-1 抗体对Mdr1 pgp 具有特异性，与 Mdr2 pgp 无交叉反应，因此

8、提高了 LPS 法的特异性。以往免疫组化结果不能进行定量分析，此方法在应用上受到一定的限制，近年来由于数学显微图像分析方法的应用，免疫组化结果可进行定量分析，使得免疫组化法更具实用性7，8。2.2 免疫印迹分析法 粗膜蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗pgp 单克隆抗体作为一抗，同位素标记的兔抗鼠 IgG 为二抗进行免疫印迹反应，分光光度计进行定量分析。此方法利用抗原抗体的特异反应，排除了其它蛋白质的干扰，但敏感性较低11。2.3 流式细胞仪（FCM）分析法 取单个核细胞分装小管，加入荧光标记的抗 pgp 单克隆抗体进行孵育，用荧光标记的小鼠 IgG 作阴性对照，PBS 冲洗除去未给合

9、的荧光抗体后，FCM 定量分析，以 20%以上细胞染上荧光者判定为 pgp阳性。FCM 检测 pgp，取材方便，可直接取肿瘤组织细胞，骨髓，还可取外周静脉血，操作简便、快速（每秒可测 5000-10000 个所要细胞）、准确，能对 pgp进行定量分析，适宜批量标本检测，但由于仪器价格昂贵，目前只有少数实验室可进行 FCM 分析法10。2.4 Northern Blot 和 Slot Blot 检测法 用异硫氰酸胍溶液抽提细胞质中RNA，氯化铯溶液进行梯度离心，抽提的 RNA 经过变性、分光光度计下测定其浓度，电泳后转移到硝酸纤维薄膜上（Slot blot 分析法则直接将 RNA 点在硝酸纤维薄

10、膜上），用 50%甲醛、5Denhardts、5SSC 溶液和 DNA 模板与放射性标记的 Mdrl cDNA 探针进行预杂交和杂交、放射自显影后分光光度计进行定量分析。通过这两种方法检测 Mdr1 mRNA 较敏感，但不足之处是需要的标本量较大，且需用放射性标记的探针，会引起同位素污染。2.5 RNA 原位杂交法 石腊包埋切片按常规处理后与放射性标记的 MdrlcDNA 探针进行杂交，放射自显影后进行结果分析。此方法采用完整细胞作为测定对象，能分析 Mdr1 过度表达的个别细胞或细胞亚群，但系手工操作，较难掌握10。2.6 RT-PCR 检测法 提取样本总 RNA，合成 cDNA，以 cDN

11、A 为模板进行 PCR扩增。PCR 反应总体积一般为 25L，含 0.1g 的模板 DNA，20mol/L,4dNTPS,Taq dNA 聚合酶 10buffer 5uL,Mdr1 基因上下游引物及内对照1 微球蛋白（2M）上下游引物各 20pmol。PCR 扩增产物经琼脂糖电泳后，紫外灯下照像，激光密度扫描仪定量分析。以2M 为定量内参标，以Mdr1/2M 的比值大小来代表 Mdr1 水平的高低。RT-PCR 产物的绝对定量很困难，因 RNA 的提取、纯度测定、cDNA 逆转率和PCR 扩增效率各个环节均影响 Mdr1 mRNA 定量分析的精确度，因此在检测过程中需要设内对照，一般选择与 M

12、dr1 基因扩增动力学相似的2M 作为内参标，以 Mdr1/2M 比值大小来衡量 Mdr1 水平的高低，从而消除上述因素引起的定量误差。由于 Mdr1 基因的多态性，在设计 RT-PCR 引物时要避开 Mdr1 和 Mdr2 基因结构的同源区，使引物具有较高的特异性，同时要使引物位于不同的外显子上，避免可能污染的基因组 DNA 扩增。RT-PCR 检测法标本用量小、特异性强、敏感性高，同时可以避免同位素污染。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是造成肿瘤化疗失败的主要原因，而Mdr1/pgp 的高表达又是 MDR 的主要机制。许多研究表明 Mdr1/pgp 与病人治疗结果密切相关，Mdr1 阳性病人生存

13、期短，缓解率低，复发率高，因此，Mdr1/pgp 的分析可作为癌症治疗结果的预测指标，也是临床医生制定治疗方案的参考依据。因此，Mdr1/pgp 的检测有其重要性。Mdr1/pgp 检测方法有多种，各具其优缺点 ，对于高表达的 Mdr1/pgp 各种检测方法所得的结果基本一致，对于低表达的 Mdr1，采用 RT-PCR 检测所得的结果较可信。由于 RT-PCR 检测方法标本用量少，敏感性高，在引物设计时，若避免与 Mdr2 基因结构的同源区，具有较高的物异性，同时又无同位素污染。因此，RT-PCR 检测法是目前检测多药耐药的一种较理想的检测方法。参考文献1 Chang J C, Douglas

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