凋亡研究进展及凋亡检测200904

1、1细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术 2009.4.212Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.3细胞凋亡（apoptosis）n概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。 4a a、凋亡概念的形成和形态学的研究凋亡概念的形成和形态学的研究(1972(1972） 19651965年发育生物学家年发育生物学家LockshinLockshin在研究硪发育过程中

2、首次提出程序化死亡在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡（programmed cell death programmed cell death ）概念。）概念。 1971 1971年年 澳大利亚生物学家澳大利亚生物学家KerrKerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。 1972 1972年年KerrKerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)(apotosis)的概念。的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。b b、DNADNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。的

3、降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987(1987）c c、蛋白质水解酶活化的研究蛋白质水解酶活化的研究(1995)(1995)d d、细胞膜的变化细胞膜的变化(1997)(1997)e e、线粒体的变化和分子生物学的研究线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)(1998-) 1) 1) 相关基因及调控相关基因及调控 2 2）信号转导）信号转导 3 3）各种分子及其相互作用及相互关系）各种分子及其相互作用及相互关系 4 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。凋亡的研究历史Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7.

4、5 细胞凋亡的研究意义n在胚胎发育过程中：通过凋亡可清除对机体无用的、多余的、发育不正常的、以及有害的细胞。n在成年机体中：通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新生的细胞；清除体内受损伤的或有癌前病变的细胞，防止癌变；凋亡还参与构成机体的防御机制。6n细胞凋亡异常是某些疾病发病的重要原因：n如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕金森氏症等，因此研究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理学、药理学等学科的热点领域。 n细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识。78坏死坏死凋亡凋亡形态学特征膜完整性丧失胞浆和线粒体膨胀 全细胞裂解 胞膜

5、出芽，但保持完整染色体聚集在核膜周边胞浆收缩、细胞核凝集最后细胞分裂为凋亡小体Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加生化特征离子内环境失调非能量依赖性的（被动过程，在4C也可以发生）随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状态）Postlytic DNA断裂 ATP依赖性的（主动过程，在4C不能发生）以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA ladder）Prelytic DNA 断裂线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、AIF）Caspases级联活化膜对称性改变（PS外翻）生理学特征影响群组细胞 由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等）被巨噬细胞吞噬 周围有明显的炎症反应只影响

6、单个细胞 由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等）被临近细胞和巨噬细胞吞噬 无炎症反应9NormalApoptosisNecrosis10细胞凋亡的信号转导通路n死亡受体信号通路n线粒体信号通路n内质网和高尔基体的信号通路n细胞凋亡的基因调控11Apoptosis-Death Receptor Signaling12TNF receptor superfamily13Cell deathFasFasLTNFTRADDFADDCas8CaseffMitCyt cProtein degradationDNase1415 1993年，研究发现秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis el

7、egans） Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1b 转化酶(interleukin-1b-converting enzyme,ICE)存在功能和序列相似性。 ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。1996年10月，推荐将ICE/Ced-3家族成员统一命名为Caspase（Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases），按发现先后为序对其家族成员以阿拉伯数字排序（1-14）。16注：W为色氨酸，E谷氨酸、H为组氨酸、D为天冬氨酸、I为异亮氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、X为任何氨基酸（by Thonberry, 1997)17Caspase活化的三

8、种方式1819破坏细胞抗凋亡因素破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNADNA片段化。现知片段化。现知caspasecaspase可可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为CaspaseCaspase激活的脱氧激活的脱氧核糖核酸酶（核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CADcaspase-activate

9、d deoxyribonulease CAD），而把它的），而把它的抑制物称为抑制物称为ICADICAD。有意义的是。有意义的是CADCAD只在只在ICADICAD存在时才能合成并显示活性，存在时才能合成并显示活性，因而因而ICADICAD对对CADCAD的活化与抑制是必需要的。的活化与抑制是必需要的。破坏细胞结构破坏细胞结构 CaspaseCaspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（LaminLamin）是由核纤）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核

10、膜的骨架结构，使染色质（使染色质（chromatinchromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被核纤层蛋白作为底物被CaspaseCaspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。染色质的固缩。影响核酸的结构与功能影响核酸的结构与功能 CaspaseCaspase可作用于多种与可作用于多种与DNADNA，RNARNA功能有关的蛋白，这些蛋白功能被抑制，功能有关的蛋白，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。 Ca

11、spase Caspase的效应机制的效应机制Nature. 2008 May 29;453(7195):583-5. 20Caspase-independent signaling pathways211、线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接结果是其正常功能的丧失。线粒体功能障碍除了会导致自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载而引起细胞凋亡外，还能直接诱导细胞凋亡。2、此通路由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl一2家族成员与另外的Bcl一2家族成员(

12、Bax亚家族成员Bax，Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆)作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C(Cytc)和其他蛋白。Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要 步骤：在ATPdATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(caspase recruitment domain，cARD)募集胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化并启动Caspase级联反应，激活下

13、游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡 。Cell. 2007 Nov 2;131(3):476-91.线粒体信号通路线粒体信号通路22 Mitochondrial Control of Apoptosis23 内质网内钙离子稳态的改变可作用于内质网功能的多个环节，引发细胞凋亡。内质网钙离子的释放在多种凋亡实验中被观察到。内质网的钙释放参与Bad和caspase在不同诱因凋亡中的激活。 破坏内质网内钙离子的稳态可以导致内质网应激，包括内质网超负荷反应，激活凋亡通路。其中内质网超负荷反应以激活转录因子NF-kB为主要特点，启动多种前炎性蛋白和细胞粘附分子的

14、转录表达，对凋亡进行调控。内质网信号通路内质网信号通路Science. 2007 Nov 9;318(5852):944-9. 24 过度内质网应激也可能涉及线粒体及细胞色素C的协同作用而使caspase激活和细胞凋亡。内质网应激介导细胞凋亡调节的一个主要因素是Caspase-12。 在多种疾病的发生发展中，内质网在完成基本生理功能的同时，作为信号传导的枢纽平台，对于细胞凋亡过程发挥着重要的调控作用。25 Bcl-2 Bcl-2家族家族 Bc1-2Bc1-2是一种原癌基因，是是一种原癌基因，是ced-9ced-9在哺在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，B

15、c1-2Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡, ,而不是促进细胞的增殖。而不是促进细胞的增殖。Bcl-2Bcl-2家族已发家族已发现现1515个成员，所有个成员，所有Bcl-2Bcl-2家族成员均含有家族成员均含有1 1个或多个个或多个BHBH结构域。蛋白含有结构域。蛋白含有4 4个个Bcl-2Bcl-2同同源结构域，依次命源结构域，依次命 名为名为BHlBHl、BH2BH2、BH3BH3和和BH4BH4。细胞凋亡的基因调控26 Bcl-2 Bcl-2亚家族亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制

16、作用 BaxBax亚家族：亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 BH3BH3亚家族：亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 作用机制作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能27 P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的

17、表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。P53P53与细胞凋亡与细胞凋亡28 IAP超家族的成员较多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有环指装结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-和-的泛素化降解作用。 IAP

18、 IAP （Inhibitor of apoptosisInhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子）细胞凋亡抑制因子）Gene. 2007 May 1;392(1-2):187-95.2930Apoptosis Assays31细胞凋亡诱导剂n化学诱导剂nH2O2n化疗药物 n物理性因子n放射线nUVn生物因子n Anti-Fas TNF Trail32细胞凋亡的形态学变化33细胞凋亡的形态学检测方法 n光学显微镜 n荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI )n电子显微镜 34光学显微镜观察35荧光显微镜观察36电子显微镜观察37细

19、胞凋亡的生物化学检测方法n磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） nTUNEL法nDNA片断化检测nDNA Ladder 测定nDNA含量分析 38磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 3940流式细胞仪分析（FACS）414243TUNEL法法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucle

20、otidyl transferase mediated nick end labeling, ）。 44TUNEL法检测原理：凋亡产生的断裂的DNA-TdT酶标记dUTP-Biotin-结合链霉亲和素-HRP-作用于底物DAB显色45Tunel 原位凋亡检测试剂盒n检测方法石蜡包埋组织石蜡包埋组织切片切片冰冻组织切片冰冻组织切片固固 定定脱脱 蜡蜡水水 合合 样本通透性的促进样本通透性的促进(蛋白酶蛋白酶K或或Triton-100处理处理)TdT酶作用下酶作用下Biotin-dUTP与样本与样本DNA的标记反应的标记反应加入加入Streptavidin-HRPStreptavidin-HRP及

21、底物及底物DABDAB的显色反应的显色反应 光学显微镜观察光学显微镜观察细胞涂片、贴细胞涂片、贴壁细胞爬片壁细胞爬片46Tunel 原位凋亡检测试剂盒n检测结果47DNA Ladder 试剂盒n检测原理n检测材料与方法 细胞或新鲜组织，裂解蛋白酶和RNA酶消化提取DNA片段琼脂糖电泳n检测结果: 琼脂糖电泳图片48DNA片断化检测nDNA Ladder49DNA含量分析碘化丙啶（碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一细胞群前出现一DNA低染细胞群，即低染细胞群，

22、即G1峰前出现亚峰前出现亚二倍体峰（二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群）即细胞凋亡群 DNA Damage2N4N2N4NG1SG2/M50细胞凋亡的分子水平检测方法nCaspase分子的检测n线粒体膜势能的检测nJC-1n凋亡相关分子的检测n促凋亡分子n抑凋亡分子n相关信号通路分子的检测51Caspase分子的检测nCaspase3、8和9，2，6等52Caspase检测方法n分光光度法检测nFACS检测nWestern Blot检测n全长检测n剪切体检测53Caspase分光光度法试剂盒n检测原理：活化的Caspase与其特异性底物DEVD- pNA 结合切割，释放出游离pNA，通过测定

23、其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。n检测材料与方法 活细胞、新鲜或速深冷冻组织制成的细胞悬液裂解蛋白定量加入底物反应测定吸光度54Caspase分光光度法试剂盒n检测结果：相同蛋白量下受试组与对照组的OD值之比或不同蛋白量OD值的变化曲线图 OD405nm 裂解蛋白量(ug)5556Caspase 3 Western Blot检测检测57n通过对Caspase底物PARP等的降解产物的检测反映Caspase的活性。 通过针对Caspase 催化的降解产物采用IHC、Western Blot、FCM进行检测。 116Kd Full length PARP85Kd Cleaved PA

24、RP58原理： JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。n线粒体膜势能（ JC-1 ）的检测n荧光显微镜检测nFACS检测59JC-1线粒体膜电位检测试剂盒n检测结果： 60线粒体膜势能的检测(JC-1)61凋亡相关分子的检测n促凋亡分子Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和cytochrome c等n抑制凋亡分子Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等n端粒酶活性检测试剂盒n氧化应激系列检测 6263相关信号通路分子

25、的检测n抗凋亡信号通路nPI3K-Akt pathwaynNIK-NF-kB pathwayn促凋亡信号通路nMKK-JNK pathwaynFas-FADD pathwaynP53 pathway64凋亡分析总体原则凋亡分析总体原则n凋亡分析总体原则：n1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；n2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；n3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。65综合解决方案凋亡或坏死？凋亡或坏死？ 死亡受体通路或

26、线粒体通路？死亡受体通路或线粒体通路？ 具体的调控分子机制具体的调控分子机制Annexin VTunelDNA contentCaspase 3, 8, 9JC-1 stainBax/Bcl-2Cytochrome CJNK pathway66 研究目的研究目的 检测指标检测指标 产品选择指南产品选择指南1 AO/EB、Hoechst33258、 PI、DAPI、 Hoechst33342/PI、罗丹明、罗丹明123试剂盒试剂盒2 AnnexinV-FITC/EGFP3 TUNEL、DNA ladder试剂盒试剂盒4 Caspase 试剂盒试剂盒1 AnnexinV-FITC/EGFP2 细胞

27、周期检测试剂盒细胞周期检测试剂盒C：判断凋亡信号通路：是：判断凋亡信号通路：是内源线粒体通路？还是外源内源线粒体通路？还是外源死亡受体通路？或内质网通死亡受体通路？或内质网通路？路？1线粒体通路：线粒体通路：JC-1、 Caspase 9活性等活性等2死亡受体通路：死亡受体通路：Caspase 8活性等活性等3内质网通路；内质网通路；Bap31等等 1 JC-11 JC-1；Caspase9Caspase9试剂盒试剂盒2 2 Caspase8Caspase8试剂盒试剂盒、蛋白抽提、蛋白抽提 蛋白定量蛋白定量试剂盒试剂盒3 KGP3 KGP系列（系列（WB/WB/免疫组化）免疫组化）D：判断各通

28、路具体的分：判断各通路具体的分子调控机制子调控机制1 MYC通路（通路（P53 AIF等）等）2 NF kappa B 通路通路3 JNK通路通路4 ARK通路通路1 RT-PCR试剂盒等分子生物学系列试剂盒等分子生物学系列2 EMSA试剂盒试剂盒3 KGP系列（蛋白抽提、蛋白定量）系列（蛋白抽提、蛋白定量）4 KGP系列（系列（WB）5 KGP系列（免疫组化）系列（免疫组化）1 Annexin V流式细胞仪分析流式细胞仪分析2 DNA含量分析等含量分析等B：判断凋亡的时期或：判断凋亡的时期或数量（定量分析）数量（定量分析）A： 判断细胞的死亡判断细胞的死亡是凋亡？还是坏死？是凋亡？还是坏死？

29、（定性分析）（定性分析）1 细胞形态学观察细胞形态学观察2 Annexin V荧光分析荧光分析3 TUNEL/ DNA Ladder分析分析4 Caspase 3活性分析活性分析67根椐实验材料类型选择检测方法和产品 实验材料类型检测方法或产品1 细胞 Annexin V-FITC/EGFP， Caspase，JC-1，TUNEL，DNA Ladder等2 新鲜组织Caspase，WB等相关产品3 冷冻组织Caspase ，TUNEL，WB等相关产品4固定组织 石蜡切片TUNEL法，免疫组化法68常见问题及解决方法n1 试验前阶段 凋亡指标的选择及实验方案的设计 A 实验材料：类型与数量 B

30、仪器条件 C 研究经费 D 论文水平69常见问题及解决方法常见问题及解决方法n2 试验阶段n A 自备试剂浓度，配制方法 n B 操作经验及注意事项n C 根椐具体材料的试验条件优化n3 结果分析n A 阴性：没结果n B 阳性：假阳性n C 结果不明显n D 结果异常70a、确定细胞凋亡发生的时间，、确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间。建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间。nb、由于、由于EDTA会络合会络合Ca2+离子，影响离子，影响Annexin V与与PS的结合，的结合，因此建议不用含因此建议

31、不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。的胰酶消化贴壁细胞。nd、因为细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。、因为细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。nb、细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而、细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在导致细胞的进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2的的BSA中。中。Annexin V凋亡检测常见问题凋亡检测常见问题71问题问题可能原因可能原因解决方案解决方案非特异性染色（例如：非非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色）凋亡细胞的强染色）Biotin-dUTPBiotin-

32、dUTP的非特异性结的非特异性结合合勿使细胞干涸勿使细胞干涸在在TdTTdT酶反应之后，再用含酶反应之后，再用含0.1% Triton X-1000.1% Triton X-100和和1 1 mg/ml BSA mg/ml BSA 的的PBSPBS洗三次。洗三次。TdTTdT酶的浓度过高酶的浓度过高用用TdT dilution bufferTdT dilution buffer* * 作作1 1：2121：1010稀释，稀释，内源过氧化物酶未被封闭内源过氧化物酶未被封闭封 闭 液 室 温 （封 闭 液 室 温 （ 1 51 5 ） 封 闭） 封 闭10min10min（封闭液：（封闭液： 3%

33、H2O2 3%H2O2溶溶于甲醇）于甲醇）光照紫外线导致包埋试剂的光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本致样本DNADNA的断裂）的断裂）尝试改用其它包埋材料或其尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂它聚合试剂在固定组织时样本在固定组织时样本DNADNA已断已断裂（内源核酸酶的作用）裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定通过肝静脉灌注固定固定后某些核酸酶活性依然固定后某些核酸酶活性依然较高导致较高导致DNADNA断裂断裂用含有用含有dUTPdUTP和和 dAPT dAPT的溶液的溶液封闭封闭TUNEL检测常见

34、问题检测常见问题72问题问题可能原因可能原因解决方案解决方案染色背景较高染色背景较高福尔马林固定导致某些含福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄黑色素前体的细胞染成黄色色尝试以甲醇固定，但可能尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。会降低检测的敏感性。内源过氧化物酶未被封闭内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（封闭液室温（1515）封闭）封闭10min10min（封闭液：（封闭液： 3%H2O2 3%H2O2溶于甲醇）溶于甲醇）Biotin-dUTPBiotin-dUTP的非特异性结的非特异性结合合在在TdTTdT酶反应之后，再用含酶反应之后，再用含0.1% Triton X-1000.1

35、% Triton X-100和和1 1 mg/ml BSA mg/ml BSA 的的PBSPBS洗三次。洗三次。样本被支原体污染样本被支原体污染使用支原体检测试剂盒检使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污测，如阳性则制备未被污染的新样本染的新样本标记反应试剂（标记反应试剂（TdTTdT酶及酶及dUTPdUTP）的浓度过高）的浓度过高稀释稀释50%50%，以降胝的标记反，以降胝的标记反应的浓度应的浓度细胞处于高度增殖期细胞处于高度增殖期在非高增殖期取样检测在非高增殖期取样检测DABDAB孵育时间过长孵育时间过长减少减少DABDAB染色时间染色时间73问题问题可能原因可能原因解决方案解决方案

36、标记率低、染色淡至无标记率低、染色淡至无如果以乙醇或甲醇固定的如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中蛋白质交联，而在操作中丢失）丢失）用溶于用溶于PBS PH7.4PBS PH7.4中的中的4%4%多多聚甲醛固定聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过过度的固定导致与蛋白过度交联度交联缩短固定时间，或用溶于缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4PBS PH7.4的的2%2%多聚甲醛固多聚甲醛固定定促渗条件不佳，以致于试促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓

37、度剂不能到达靶分子或浓度过低过低增加通透剂促渗时间增加通透剂促渗时间增加通透剂的作用温度增加通透剂的作用温度（1515）优化蛋白酶优化蛋白酶K K的作用浓度和的作用浓度和作 用 时 间 （ 如 ： 以作 用 时 间 （ 如 ： 以400ug/ml400ug/ml作用作用5min5min）的柠檬酸钠作用的柠檬酸钠作用30min30min。74问：问： 电泳结果中电泳结果中DNA 片段模糊，得不到清晰的片段模糊，得不到清晰的Ladder，原因是什么？，原因是什么？答：可以考虑以下原因：答：可以考虑以下原因： 细胞凋亡进行过度，有非特异性的细胞凋亡进行过度，有非特异性的DNA 片段。推荐提早取样时间

38、。片段。推荐提早取样时间。 操作中混入操作中混入DNase。应防止。应防止DNase 混入（如实验戴手套等）。混入（如实验戴手套等）。 n问：电泳结果无问：电泳结果无DNA 片段检出，为什么？片段检出，为什么？n答：可以考虑以下原因：答：可以考虑以下原因：n 没有发生细胞凋亡。可使用凯基没有发生细胞凋亡。可使用凯基TUNEL试剂盒等确认细胞凋亡是否发生。试剂盒等确认细胞凋亡是否发生。n DNA 量太少，无法检出。增加处理样品的细胞数或者尽可能使用少量的量太少，无法检出。增加处理样品的细胞数或者尽可能使用少量的TE Buffer 溶解溶解提取样品提取样品DNA。 n问：问： Solution A

39、 低温下产生沉淀，怎么办？低温下产生沉淀，怎么办？n答：在答：在40左右加热，即可溶解。溶解后的溶液可以正常使用，不影响实验结果。左右加热，即可溶解。溶解后的溶液可以正常使用，不影响实验结果。 n问问 贴壁细胞用什么方法剥离细胞较好？贴壁细胞用什么方法剥离细胞较好？n答答 用细胞刮勺剥离较好，与使用用细胞刮勺剥离较好，与使用Trypsin 剥离细胞方法相比，前者剥离的细胞的片断化剥离细胞方法相比，前者剥离的细胞的片断化DNA Ladder较为清晰。较为清晰。 DNA Ladder 检测常见问题检测常见问题751 JC-1避光保存及使用。避光保存及使用。2 细胞培养的数量不宜超过细胞培养的数量不宜超过1106，否则细胞会产生自然凋，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。亡影响检测。3 有些对有些对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间孵育染色及洗涤，或延长观测时间4 流式细胞仪检