流式细胞术应用概述

1、流式细胞术应用概述流式细胞术应用概述流式细胞术系列讲座之流式细胞术系列讲座之概述概述=流式细胞术的一般介绍流式细胞术的一般介绍=流式细胞术在临床检测和科研中的应用流式细胞术在临床检测和科研中的应用=免疫学检测和科研应用=肿瘤学检测和科研应用=凋亡分析=血液学检测和科研应用=其它应用主要内容主要内容 流式细胞术的一般介绍流式细胞术的一般介绍第第 一一 部部 分分什么是流式细胞术？什么是流式细胞术？ 流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。流式细胞术流式细胞术(Flow Cytomet

2、ry，FCM):是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。流式细胞仪特点n多参数测量和分析（散射光和荧光）；多参数测量和分析（散射光和荧光）；n快速测量和分析快速测量和分析n每秒可达1000-10000个细胞n分选纯度可达99%以上。n获取的数据分析结果更具有统计学意义；获取的数据分析结果更具有统计学意义；n通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒球非生物颗粒FACSCal

3、ibur流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞颗粒性程度细胞颗粒性程度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量细胞功能细胞功能=细胞表面蛋白抗原细胞表面蛋白抗原=细胞胞浆内蛋白性细胞胞浆内蛋白性抗原抗原=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=细胞增殖细胞增殖=细胞内钙离子浓度细胞内钙离子浓度流式细胞仪分析数据常见图形：（二维）点阵图 (Dot Plot)适用于：双参数分析适用于：双参数分析流式细胞仪分析数据常见图形： 直方图(Histogram Plot)适用于：适用于：单参数分析单参数分析仅需要观察某仅需

4、要观察某个荧光强度的个荧光强度的变化变化流式细胞仪分析图谱nSSC（侧向散射光）（侧向散射光）-反应细胞内颗粒多少反应细胞内颗粒多少FSC（前向散射光）（前向散射光）-反应细胞大小反应细胞大小散射光信号散射光信号 特征信息荧光（特征信息荧光（FluorescenceFluorescence）信号）信号nFL1 （第一荧光）（第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素）异硫氰酸荧光素）nFL2 （第二荧光）（第二荧光） -PE（藻红蛋白）（藻红蛋白）nFL3 （第三荧光）（第三荧光） -PerCP, PeCy5等等nPL4 （第四荧光）（第四荧光） -APC（藻青蛋白）（藻青蛋白）流式细胞仪分析图谱

5、双色直接染色双色直接染色设门：选择要分析的细胞群体设门：选择要分析的细胞群体设定阴性、阳性范围设定阴性、阳性范围流式细胞术在临床检测和科研中的应用流式细胞术在临床检测和科研中的应用第第 二二 部部 分分一、免疫学检测和科研应用一、免疫学检测和科研应用1、细胞表面分子标记、细胞表面分子标记（以淋巴细胞亚群检测为例）（以淋巴细胞亚群检测为例）原理n人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。nT淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4和CD8T细胞两个亚群；nB淋巴细胞特异性标志为CD19；nNK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达

6、CD3n利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进而得到各亚群的比例。 T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cellsT cells, T subsets, NK cells, B cells淋巴细胞亚群及功能淋巴细胞亚群及功能T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)名名 称称功功 能能辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和

7、体液免疫抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- 表达 / T细胞受体(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ 记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T细

8、胞, 感染时升高 感染时升高调节性T细胞（Treg)具有免疫抑制作用活化活化T淋巴细胞淋巴细胞名名 称称功功 能能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味着HIV患者的预后较差CD19+CD23+ 活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞 自身免疫性疾

9、病时降低, 而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 淋巴细胞亚群及功能淋巴细胞亚群及功能淋巴细胞亚群与疾病淋巴细胞亚群与疾病疾疾 病病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血 重症肌无力免疫缺陷病 爱滋病病毒感染 传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症淋巴细胞亚群检测意义淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究 疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶

10、险感染 2CG2/MG2/M期细期细胞胞,DNA,DNA含量开含量开始增加至始增加至4C4C1、正常细胞、正常细胞DNA含量稳定在含量稳定在2C水平水平2、性细胞、性细胞DNA含量为含量为1C3、处于增殖期至分裂期细胞由、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至增加至4C4、凋亡细胞、凋亡细胞DNA断裂断裂,含量含量2C细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量 Channels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120Dip

11、loid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23DebrisAggregatesApoptosisDip G1Dip G2Dip SG0/G1SG2/MChannels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21Aneupl

12、oid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SAn1 G1An1 G2An1 S可检测标本可检测标本n新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。术活检、细针穿刺物等。n冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织n常规固定常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡包埋用于组织检查的样本（蜡块）。

13、块）。n通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。n蜡块包埋的标本需进行特殊处理蜡块包埋的标本需进行特殊处理 意义意义70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍体和倍体和S期比例期比例-指导治疗指导治疗2 卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 -早期早期 (I/I

14、I期期)DNA倍体和倍体和DNA指数指数-预后长期和无病生存期预后长期和无病生存期2 卵巢癌卵巢癌-晚期晚期 2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999 2、肿瘤相关基因编码蛋白检测P53乳腺癌 与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关 大肠肿瘤 早期发现大肠癌胃 癌 与预后相关肝细胞癌 与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达 造血系统细胞 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮,

15、子宫内膜等 干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 神经元 胚胎组织Bcl-2在肿瘤组织中的表达 肾脏肿瘤 肾癌, 肾盂乳头瘤, Wilms瘤, 肾嗜酸细胞瘤 前列腺癌 B细胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲状腺癌nm23nm23与多种肿瘤的转移及预后相关 肝细胞癌 甲状腺肿瘤 乳腺癌 结肠癌 肉瘤CD44(CD44s/CD44v)人人 体体 肿肿 瘤瘤CD44 亚亚 型型与肿瘤的临床相关性与肿瘤的临床相关性肺癌非特异总 CD44 表达的下调与较差的预后相关胃肠道癌CD44v9胃肠道肿瘤的独立的预后指标CD44v8-v10与肝转移相关,并为结直肠癌的独立的预后指标CD44

16、v6与肠癌的浸润相关恶性黑色素瘤CD44v5与侵润性相关乳腺癌CD44v6受雌激素和孕激素调控CD44v3/v4, CD44v6肿瘤分级,但不是独立的预后指标CD44s, CD44v6肿瘤分级,但不是独立的预后指标甲状腺癌(乳头型)CD44v6与淋巴节转移相关非何杰金氏淋巴瘤CDv3, v6, v9与较差预后相关神经母细胞瘤CD44s总 CD44 表达的下调与较差的预后相关3、 Cyclin(细胞周期蛋白)检测P-gp在肿瘤组织中的表达 乳腺癌, 膀胱癌, 胃癌, 食管癌, 卵巢癌, 前列腺癌等 化疗前高表达化疗后高表达 肾细胞癌, 结肠癌, 肝癌,肾上腺皮质癌, 胰腺癌等 化疗前低表达 非何

17、杰金氏淋巴瘤, 成神经细胞瘤, 急性髓白血病等 化疗不敏感化疗敏感化疗不敏感4、肿瘤多药耐药性(MDR)检测4、凋亡检测详见下一部分三、三、流式细胞术分析凋亡流式细胞术分析凋亡 细胞凋亡与疾病的关系细胞凋亡与疾病的关系 该该“死死”的细胞不死，的细胞不死，不该不该“死死”的细胞却死了，也就是说的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度无论凋亡过度或凋亡不足或凋亡不足都可以导致疾病的发生。都可以导致疾病的发生。n细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病n细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染退行性疾病，病毒感染n不足与过

18、度并存：动脉粥样硬化不足与过度并存：动脉粥样硬化凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡过程细胞凋亡过程 在凋亡诱导因素的作用下线粒体的膜电位改变caspase家族激活磷脂酰丝氨酸外翻DNA断裂形成凋亡小体凋亡的检测方法凋亡的检测方法1. 形态学检测形态学检测n光学显微镜 n荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI )n电子显微镜 2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（可用FCM）3.线粒体膜势能的检测 （可用FCM）4. DNA片断化检测 （可用FCM）5. TUNEL法 （可用FCM）6. Caspase-3活性的检测 （可用FCM）7. 凋亡相关分子的检测（可用FCM）n

19、促凋亡分子: Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid 等n抑凋亡分子: Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等8. 相关信号通路分子的检测（可用FCM）1.磷脂酰丝氨酸外翻分析磷脂酰丝氨酸外翻分析(ANNEXIN V标记法标记法)【原理】1. 细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻；2. Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合 ；3. 碘化丙啶(propidine iodide, PI)可以区分活细胞和死细胞。 结果分析结果分析结果分析结果分析-优优结果分析结果分析-差差如何获得好的结果如何获得好的结果n细胞状态要好；细胞状态要好；n细胞处理的火候问题

20、：药物浓度、时间需要摸索；细胞处理的火候问题：药物浓度、时间需要摸索；n染色后，不能固定细胞，应尽快检测。染色后，不能固定细胞，应尽快检测。2.线粒体膜势能的检测线粒体膜势能的检测 【原理【原理】n线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡细胞凋亡则不可逆转。则不可逆转。n线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的到线粒体基质，其荧光的增强或减

21、弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。增高或降低。n常用染料有：常用染料有：Rhodamine 123 、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide DiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等等 结果分析结果分析3.DNA片断化检测片断化检测n通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同“DNA倍体分析和细胞周期分析”Channels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120

22、Channels (FL2-A-FL2-Area)0204060801001204.TUNEL法法n流式也能进行流式也能进行TUNEl检测，检测，其检测原理与经典其检测原理与经典TUNEl原原理基本一致。利用理基本一致。利用TdT能将能将荧光素标记的荧光素标记的dUTP标记到标记到断裂的断裂的DNA末端，从而使凋末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。亡的细胞具有荧光。n流式检测后，可以进行精确流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，的计算凋亡百分比。这一点，经典经典TUNEl是做不到的。是做不到的。 经典经典TUNEL法原理法原理结果分析结果分析结果分析结果分析结合细胞结合细胞DNA含量分

23、析效果更佳含量分析效果更佳5.Caspase-3活性的检测活性的检测 nCaspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子。nCaspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。n用荧光标记的抗活化Caspase-3的抗体进行胞内染色，可以通过流式细胞术分析其活性n在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降 四、四、流式细胞术在血液学中的应用流式细胞术在血液学中的应用1、流式

24、细胞术白血病免疫分型流式细胞术白血病免疫分型白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。型是准确、及时治疗的前提。急性白血病的分型基本上分三个阶段：急性白血病的分型基本上分三个阶段：FAB分型分型(1976)(morphology，M )MIC分型分型（1986）(morphology，M )(immunology， I ) ( cytogenetics，C )WHO分型分型(2001)（MICM）(morphology，M )(immu

25、nology， I ) ( cytogenetics，C)(molecular biology, M) 急性白血病分型历史急性白血病分型历史急淋急淋（ALL）急性白细胞急性白细胞FAB分型分型急非淋急非淋（ANLL）急性髓细胞白急性髓细胞白血病血病(AML)L1型型L2型型L3型型M0: 微分化型髓系白血病； M1：未分化的原粒细胞白血病；M2：部分分化的原粒细胞白血病；M3：急性早幼粒细胞白血病；M4：急性粒、单核细胞白血病；M5：急性单核细胞白血病；M6：急性红血病或红白血病；M7：急性巨核细胞白血病。MIC分型以形态学为基础、免疫学和细胞遗传学作补充，分型以形态学为基础、免疫学和细胞遗传

26、学作补充，相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。方法的重要补充。MIC分型分型形态学形态学 (morphology， M ) ：传统的骨髓片检查免疫学免疫学 (immunology， I ) ：免疫组化 流式细胞术 细胞遗传学细胞遗传学 ( cytogenetics，C ) ：染色体分型利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞内的免疫标志，可准确反映白血病细胞的所属系列内的免疫标志，可准确反映白血病细胞的所属系列（TB髓）及分化程度。髓）及分化程度。检测分析时，首先根据

27、检测分析时，首先根据CD45表达强弱和细胞颗粒表达强弱和细胞颗粒度，在度，在CD45-SSC图中确定幼稚或异常的细胞群体。图中确定幼稚或异常的细胞群体。然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率。然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率。白血病免疫分型原理白血病免疫分型原理流式细胞术白血病免疫分型优点流式细胞术白血病免疫分型优点 细胞形态学，免疫学和细胞遗传学三者相结合是当今公认的白血病分型方案，其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。流式细胞仪可方便、快速、准确地完成白血病的免疫学分型，其意义在于： 准确寻找和计数幼稚或异常的细胞群体； 用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病； 形态学

28、为急性淋巴细胞白血病（ALL），但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记； 混合性白血病； 帮助确定髓系白血病所属类型； 慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤； 微小残留白血病。 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合CD3CD79aMPO可以确定白血病分别属于可以确定白血病分别属于T/B/髓系髓系表面染色表面染色胞内染色胞内染色T系：系：CD2、CD5、CD7B系：系：CD10、CD19、CD20髓系：髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33非系列特异的抗体：非系列特异的抗体：CD34、HLA-DR全全套套进一步进一

29、步细分细分其它其它必要时可以加用必要时可以加用泛白细胞标志：泛白细胞标志：CD45标本来源（1 1）外周血）外周血（2 2）骨髓穿刺液，）骨髓穿刺液，（3 3）骨髓活检标本）骨髓活检标本（4 4）淋巴组织穿刺）淋巴组织穿刺样本保存 要要 求：求：n室温条件室温条件(16 -28 )存放；存放；n 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液体（如体（如 生理盐水或组织培养液）。生理盐水或组织培养液）。保存时间n肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小小时；时；nEDTA抗凝标本，存放时限只有抗凝标本，存放时限

30、只有12 24小时，因为小时，因为髓细胞在此条件下会裂解；髓细胞在此条件下会裂解；n柠檬酸（柠檬酸（ACD）抗凝的外周血标本可存放）抗凝的外周血标本可存放72小时以上。小时以上。但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的ACD会引起会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡值变化而导致骨髓细胞死亡正常骨髓流式分析图CD45/SSC 图中可见：nCD45 强阳性SSC 低信号的细胞群为淋巴细胞(褐色细胞群体)n中等强度的CD45 表达SSC 信号最强的细胞群体为粒细胞(蓝色及红色细胞群体)nCD45 表达与SSC 信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体

31、(绿色细胞群体)nCD45 阴性SSC 信号最低的有核红细胞和细胞碎片n根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细胞nR1 门为成熟淋巴细胞nR2 门为正常单核细胞位置nR3 门正常粒细胞位置nR4 门为幼稚淋巴细胞出现位置nR5 门为有核红细胞或细胞碎片位置nR6 门为幼稚髓细胞出现位置n白血病细胞通常会在R4 R6 两门位置处出现举例B-ALLCD19、CD20、CD10、cCD72、CD34、HLA-DR阳阳性性M3:nCD13和和/或或CD33阳性，阳性，CD15阳性，阳性，CD34、HLA-DR、CD14阴性，偶阴性，偶尔表达尔表达CD2。MPO阳性。阳性。混合表型混合

32、表型n目前急性白血病的分类仍较复杂，目前急性白血病的分类仍较复杂，流式细胞术免疫分流式细胞术免疫分型能提高分型的准确性，但不是疾病的诊断型能提高分型的准确性，但不是疾病的诊断。n理想分类法应该以形态学为基础，结合免疫学和细胞理想分类法应该以形态学为基础，结合免疫学和细胞遗传学、分子生物学提供信息。遗传学、分子生物学提供信息。n国际血液学家及血液病理学家国际血液学家及血液病理学家20012001年年3 3月里昂会议上的月里昂会议上的造血和淋巴组织肿瘤的造血和淋巴组织肿瘤的WHOWHO分类法，应用分类法，应用MICMMICM分类技术分类技术力求反映疾病本质，成为国际上一种新的分类标准。力求反映疾病

33、本质，成为国际上一种新的分类标准。白血病免疫分型总结白血病免疫分型总结2、流式细胞术多发性骨髓瘤免疫检测流式细胞术多发性骨髓瘤免疫检测正常浆细胞与骨髓瘤细胞在免疫表型上存在明显差异，前正常浆细胞与骨髓瘤细胞在免疫表型上存在明显差异，前者为者为CD38+CD19+CD56-，而后者则为，而后者则为CD38+CD19-CD56+/-。此外，此外，B系的其他标志（如系的其他标志（如CD10、CD20等），非等），非B系标系标志（如志（如CD2、CD5、CD7、CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD14等）在骨髓瘤细胞中也可能有异常表达。等）在骨髓瘤细胞中也可能有异常表达。因此，通过多参数流

34、式细胞术，进行多种表面标志标记，因此，通过多参数流式细胞术，进行多种表面标志标记，可以很方便地区分正常浆细胞和骨髓瘤细胞，对可以很方便地区分正常浆细胞和骨髓瘤细胞，对MM的诊断的诊断和预后判断有重要价值。和预后判断有重要价值。【原理【原理】3、网织红细胞血小板检测n计数外周血中检测网织红细胞和网织血小板4、血小板自身抗体检测n血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。n血小板活化实验血小板活化实验n活化标志：活化标志：CD62P（P选择素）、选择素）、PAC-1（IIbIIIa复合物）复合物）n血小板特

35、异性标志：血小板特异性标志：CD615、血小板功能分析 6、夜间阵发性血红蛋白尿正常人正常人CD55和和CD59表达完全阳性。表达完全阳性。PNH表达分三型（以表达分三型（以CD59为例）：为例）：I型，型，CD59表达完全阳性，荧光强度同正常人；表达完全阳性，荧光强度同正常人；II型，型， CD59表达部分阳性，荧光强度介于表达部分阳性，荧光强度介于I和和III型型之间；之间；III型，型， CD59表达完全阴性。表达完全阴性。7、造血干细胞检测、造血干细胞检测干细胞的特征干细胞的特征细胞特征细胞特征祖细胞的流式细胞仪特征祖细胞的流式细胞仪特征CD34CD34表达表达对对CD34CD34的反

36、应性：强的反应性：强CD45CD45表达表达对对CD45CD45的反应性：弱的反应性：弱阴性阴性DNA/RNADNA/RNA含量，核酸染料含量，核酸染料摄取量摄取量祖细胞祖细胞DNA/RNADNA/RNA含量较多，染色性较强含量较多，染色性较强大小（前向散射光）大小（前向散射光）祖细胞直径约祖细胞直径约8 810m10m，与大淋巴细胞，与大淋巴细胞前向散射光位置相同，也可能伸入单核前向散射光位置相同，也可能伸入单核细胞区域。细胞区域。粒度（侧向散射光）粒度（侧向散射光）祖细胞的侧向散射光弱，与淋巴细胞、祖细胞的侧向散射光弱，与淋巴细胞、大淋巴细胞相似。大淋巴细胞相似。CD34、CD45与核酸染

37、料联合应用，通过合理的设门策与核酸染料联合应用，通过合理的设门策略才能够准确检测略才能够准确检测CD34+干细胞比例；干细胞比例；也可以用相关试剂盒进行绝对计数也可以用相关试剂盒进行绝对计数五、五、流式细胞术在科研中的其它应用流式细胞术在科研中的其它应用1、流式细胞术检测吞噬细胞的吞噬活性、流式细胞术检测吞噬细胞的吞噬活性吞噬细胞吞噬细胞小吞噬细胞小吞噬细胞大吞噬细胞大吞噬细胞中性粒细胞中性粒细胞单核细胞单核细胞单核细胞巨噬细胞单核细胞巨噬细胞中性粒细胞中性粒细胞举例举例流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能荧光素标记细菌荧光素标记细菌中性粒细胞吞噬荧光素标记的细菌中

38、性粒细胞吞噬荧光素标记的细菌快速、客观、快速、客观、重复性好重复性好 大肠埃希菌 金葡菌85.5445.6154.9593.6440.4553.1088.7593.865min10min15min20min 表示表示表示表示37 吞噬率吞噬率- 表示表示0 15min吞噬率。吞噬率。人人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图Cayman吞噬功能检测试剂盒吞噬功能检测试剂盒（可采用流式细胞仪或荧光显微镜等检测）（可采用流式细胞仪或荧光显微镜等检测） 分析分析PMA刺激增加刺激增加THP-1细胞株的细胞吞噬功能细胞株的细胞吞噬功能方便！直观！快速！方

39、便！直观！快速！ 细胞吞噬功能涉及多发性硬化、细胞吞噬功能涉及多发性硬化、Alzheimer、动脉粥样、动脉粥样硬化，细菌，霉菌等众多疾病的研究，是细胞功能变硬化，细菌，霉菌等众多疾病的研究，是细胞功能变化的一个重要方面。化的一个重要方面。pHrodo 噬菌作用流式分析试剂盒（噬菌作用流式分析试剂盒（100 assays）n快速标记生物微粒，用于细菌和全血的噬菌作检测。快速标记生物微粒，用于细菌和全血的噬菌作检测。2、免疫细胞细胞毒活性流式检测、免疫细胞细胞毒活性流式检测细胞毒活性检测方法MTT法法3H-TdR摄入法摄入法 流式法流式法CFSE/PI双标记法双标记法实验原理1.1.羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯( (CFDA-SECFDA-SE、CFSECFSE) ) 是一种膜通透性的荧光素染料，是一种膜通透性的荧光素染料， 能与胞内蛋白中的氨基反应能与胞内蛋白中的氨基反应形成稳定的染料蛋白加合物（绿色）形成稳定的染料蛋白加合物（绿色）2.2.碘化丙啶碘化丙啶 ( (PIPI) ) 是一种膜非通透性的荧光素染料，不能通过活