基于荧光金纳米簇的高灵敏度硫脲检测

1、 目录摘要1关键词1前言3第一章 实验部分51.1实验试剂及仪器51.2 溶液的配制51.3 实验过程51.3.1以牛血清蛋白为模板的金纳米簇的制备51.3.2硫脲（Tu）抑制BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光猝灭61.3.3其他物质对抑制BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光猝灭6第二章 结果与讨论62.1 BSA-AuNCs的表征62.2 BSA-AuNCs间接检测硫脲72.3实验条件的优化92.4 BSA-AuNCs荧光探针的选择性17第三章 总结17参考文献18致谢20基于荧光金纳米簇的高灵敏度硫脲检测摘要近年来随着纳米技术的发展，纳米材料作为一种新

2、型荧光材料被广泛运用到分析领域1。目前已研究发现的荧光纳米材料主要包括以下几种：有机染料、聚合物点、碳量子点、半导体量子点、荧光金属纳米簇(FM NCs)等2-5。金纳米簇是一种尺寸小于3 nm的一种新型荧光材料，因其具有易合成、光稳定性高、低毒性等突出优势，被广泛用于各种目标物的检测。在本论文中，我们以牛血清蛋白为模板合成荧光金纳米簇。研究发现在向金纳米簇中加入碘离子、过硫酸盐以及铜离子时，其荧光发生明显的猝灭；如果同时加入硫脲，荧光发生恢复。通过荧光金纳米簇的恢复程度，可以实现对硫脲的灵敏检测。在最佳条件下，荧光的猝灭程度与硫脲的浓度呈一定的线性关系，其线性范围是0.2-4.0 M，检测限

3、可达0.03 M，有望实现实样检测。关键词：金纳米簇，荧光增强，过硫酸盐，碘离子，铜离子，硫脲AbstractIn recent years, with the development of nanotechnology, nanomaterials have been widely used in the analysis field as a kind of novel fluorescent material. The fluorescent nanomaterials that have been studied so far include mainly organic dyes,

4、polymer dots, carbon quantum dots, semiconductor quantum dots, fluorescent metal nanoclusters (FM NCs) and so on. Gold nanoclusters are a novel fluorescent material with a size of less than 3 nm. They are widely used for the detection of various targets due to their outstanding advantages such as ea

5、sy synthesis, high light stability, and low toxicity.In this paper, we synthesize fluorescent gold nanoclusters using bovine serum albumin as a template. When iodide, persulphate, and copper ions are added to gold nanoclusters, the fluorescence is significantly quenched. However, when thiourea is ad

6、ded at the same time, the fluorescence was recovered. Under an optimized condition, the extent of quenching was found linearly related to thiourea concentration in the range of 0.2-4.0 M, and thiourea as low as 0.03 M could be detected. This method is expect to implement real sample t

7、esting.Keywords: Gold nanoclusters；Fluorescence enhancement；Iodine；Copper ions；Thiourea基于荧光金纳米簇的高灵敏度硫脲检测前言荧光金纳米簇，又称纳米点，其尺寸一般小于3 nm，是一种新兴荧光纳米材料。与被研究者们熟悉的一般金属纳米颗粒不同，在可见光区域即可测得其紫外吸收峰，在可见光区域到近红外区域都可测得其荧光发生峰。正因为荧光金纳米簇具有较长的荧光寿命、较大的斯托克斯位移值、较好的生物相容性和光化学稳定性以及易于合成标记等优点，因此荧光金纳米簇被广泛应用于重金属离子检测、无机阴离子检测、生物小分子检测以及蛋

8、白质检测和生物成像中6-9。本文中我们同样利用金纳米簇的性质，建立检测硫脲的荧光方法。近年来，研究者们已经建立了许多合成AuNCs的方法，其中主要分为以下几类：第一类是单分子层保护法。顾名思义，就是将某种分子修饰或者组装在金纳米簇表面，使其具有某种特定功能的合成方法。现在这种方法主要使用的保护分子层是硫醇类化合物，包括十一巯基烷酸（MUA）10、二氢硫辛酸（DLHA）11、十二巯基硫醇（DDT）12等，这种方法制备得到的金纳米簇具有较小的粒径、较大的斯托克斯位移，而且副产物较少。第二类是配体蚀刻法13-14。此方法通过在前驱体中加入刻蚀剂，使它们发生反应，从而改变金纳米簇中的核原子数目。但是这

9、种方法的刻蚀一般是不完全的，会有较大的纳米颗粒残留，从而导致所合成的AuNCs量子效率低。第三类是模板法17。模板法是选取不同的大分子，如蛋白质、聚合物、DNA等作为模板，其中模板物质通过提供不同的空间与框架，可以用来合成核心尺寸不一样、核心原子数不一样和形态不一样的金纳米簇。虽然合成金纳米簇的方法有很多，但模板法更具优势。因为金纳米簇只有具备良好的荧光强度和光稳定性，我们才能将其有效的应用于各个领域。这些优良的光物理性质需要我们选择合适的稳定剂配体及模板物质，这也是研究金纳米簇合成方法的重点。近年来，有研究者以牛血清蛋白为模板合成金纳米簇15，这种方法绿色简便。牛血清蛋白(BSA)是一种很容

10、易获得的生物物质，以BSA为模板的金纳米簇有很好的生物相容性，且光学稳定性强。本论文即采用这种方法制备BSA。但是由于金纳米簇的荧光受到pH，反应温度，离子强度等因素的影响，所以反应条件需要优化。本实验使用的BSA-Au NCs，同样需要对反应时间，pH，反应物浓度等条件进行优化。硫脲是一种有机硫化物，应用范围广泛，可用于合成磺胺噻唑、蛋氨酸和肥猪片等药物，还是合成染料及染色助剂、树脂、橡胶的硫化促进剂和金属矿物的浮选剂的重要原料，甚至在显影剂、调色剂以及电镀工业有所应用22。但是硫脲具有一定毒性，且被世界卫生组织国际癌症研究机构列入致癌清单中，所以实现硫脲的高灵敏度高选择性的检测具有重要意义

11、。第一章 实验部分1.1实验试剂及仪器氯金酸（HAuCl4·4H2O），氢氧化钠（NaOH），磷酸氢二钠（Na2HPO4），柠檬酸（C6H8O7），碘化钾（KI），氯化钾（KCl），氯化钠（NaCl），硫酸铜（CuSO4），硫脲（CH4N2S），过硫酸钾（K2S2O8），甘氨酸（Gly），组氨酸（His），赖氨酸（Lys），半胱氨酸（L-cys），牛血清蛋白（BSA）均来自国药化学试剂有限公司。实验过程中所用的水均为二次蒸馏水。实验所用的试剂均为分析纯。紫外可见分光光度计（TU-1901双光束，北京普析通用仪器有限责任公司）；荧光光度计（F4600，日本日立）；紫外灯（365 nm，

12、广州雪莱特光电科技股份有限公司）；pH计（PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司）。1.2 溶液的配制50 mg/mL的BSA溶液：用蒸馏水溶解2.5 g的BSA粉末并定容至50ml;1 mol/L的NaOH溶液：取2 g NaOH用蒸馏水溶解并定容至50ml；0.1 mol/L的KI溶液：取0.83 g KI用蒸馏水溶解并定容至50ml；0.4 mol/L的Na2HPO4溶液：取7.16 g Na2HPO4用蒸馏水溶解并定容至50 ml；实验过程中所用的玻璃仪器都用铬酸洗液浸泡过夜，然后经亚沸水洗涤干净。1.3 实验过程1.3.1以牛血清蛋白为模板的金纳米簇的制备根据文献报道的以牛血清蛋

13、白为模板的金纳米簇合成路线15如下：首先用亚沸水将0.1 g/mL氯金酸溶液稀释至10 mmol/L，然后取5 mL10 mmol/L的氯金酸，将其加入到5 mL50 mg/mL的牛血清蛋白溶液中，并将溶液放入37 水浴中，并且打开搅拌器剧烈搅拌。反应2 min后，将0.5 mL1mol/L的NaOH溶液加入到混合溶液中，并在水浴中搅拌反应24 h。反应过程中溶液的颜色从起始的亮黄色逐渐转变成浅棕色，最终变成深棕色。反应结束后，在4 的冰箱中将BSA-AuNCs保存以备用。1.3.2硫脲（Tu）抑制BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光猝灭实验过程中，将Cu2+、K2S2O8、

14、KI以及不同浓度的Tu先加入到柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，反应一段时间后，再将稀释后的BSA-AuNCs加入体系，一段时间后在激发波长为365 nm时测定体系的荧光发射光谱。由于体系的荧光强度受到pH，离子强度等因素影响，同时为了提高方法的选择性以及灵敏度，对实验条件进行了详细的筛选。1.3.3其他物质对抑制BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光猝灭在以上基础上，实验过程中还测定了其他可能对BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光恢复产生影响的物质，如：氯化钾（KCl），氯化钠（NaCl），甘氨酸（Gly），组氨酸（His），赖氨酸（Lys），柠檬酸（CA）。第

15、二章 结果与讨论2.1 BSA-AuNCs的表征实验中所合成的BSA-AuNCs颜色为深棕色，在紫外灯（365 nm）的照射下可以观察到明显的红色荧光，与文献报道的紫外光谱相一致15，这表示合成的BSA-AuNCs是可用的。如图1所示，其紫外光谱表明BSA-AuNCs在275 nm处有一个比较明显的特征吸收峰，该峰表明体系中可能存在芳香族残基以及二硫键16。图1：BSA 与BSA-AuNCs的紫外可见吸收光谱，其中a为BSA-AuNCs紫外可见吸收光谱，b为BSA的紫外可见吸收光谱。2.2 BSA-AuNCs间接检测硫脲为了验证实验的可行性，我们首先将Cu2+，K2S2O8，KI加入到柠檬酸-

16、磷酸氢二钠缓冲溶液中，在其中一个样品中加入Tu，反应一段时间后，再将用0.4 mol/L的Na2HPO4溶液稀释30倍的BSA-AuNCs以1:10比例加入体系，通过其荧光发射光谱可发现明显的荧光恢复现象（如图2所示）。此外通过在样品中添加淀粉溶液（如图3所示），我们发现硫脲可以抑制BSA-AuNCs-Cu2+-S2O82-I-体系荧光猝灭。具体图示如下：图2：不同体系的荧光发射光谱图：其中a是同时加入K2S2O8，KI，Cu2+和BSA-AuNCs的荧光发射图谱，b是同时加入K2S2O8，KI，Cu2+，BSA-AuNCs和Tu的荧光发射图谱图3：左：C(I-)=3 mM，C(K2S2O8)

17、=0.5 mM，C(Cu2+)=10 M，右：C(I-)=3 mM， C(K2S2O8)=0.5 mM，C(Cu2+)=10 M，C(Tu)=30 M。由于过硫酸钾有强的氧化性，碘离子有强的还原性，所以I-很容易被氧化成I2，此时体系中实际上是I2与过量I-共存，由于I2/I-混合物对金元素具有很强的刻蚀作用，所以导致其对纳米簇有更强的降解作用，从而获得更加高效的荧光猝灭18，同时由于铜离子对过硫酸钾和碘离子的氧化还原反应起到催化作用19-20，且硫脲与铜离子可形成稳定的螯合物23，所以加入硫脲后，体系中铜离子浓度降低，催化效果降低，产生的I2减少，体系的荧光发生恢复，具体的工作原理如下图所示

18、：图4：体系的工作原理图。指的是铜离子催化碘离子与过硫酸盐反应使BSA-AuNCs荧光猝灭的过程；指的是铜离子与硫脲反应生成螯合物的过程。2.3实验条件的优化在证实了实验方法的可行性后，为了提高方法的灵敏度，我们对实验条件进行一系列优化。首先我们对pH进行了筛选，因为溶液的pH不仅会影响碘离子与过硫酸盐反应，而且还会对I2/I-对金纳米簇的刻蚀作用产生影响21，从而影响体系的荧光恢复程度。所以我们分别测定了pH对碘离子与过硫酸盐反应的影响，以及对金纳米簇荧光的影响。通过对不同pH下铜离子催化I-与S2O82-反应结果进行比较，我们发现当溶液pH=3时此反应可以生成大量I2，而pH大于3时，溶液

19、中产生的I2很少（如图5所示）。所以取pH=3作为第一段反应的最佳pH。之后我们测定不同pH柠檬酸-磷酸氢二钠的缓冲溶液中金纳米簇的荧光猝灭率，我们可以看到当pH=7时，I2对金纳米簇的猝灭效果最好（如图6所示）。因此我们实验过程总体分为两步，第一步我们先将Cu2+，K2S2O8，KI以及Tu加入到pH=3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，反应一段时间；第二步再将用0.4 mol/L的Na2HPO4溶液稀释30倍的BSA-AuNCs以1:10比例加入体系，将体系中的pH调至7，再反应一段时间，之后测量体系的荧光发射光谱。图5：所有试管中都加了0.5 mM K2S2O8，3 mM KI，10 M

20、Cu2+，且反应120 min后加入淀粉溶液。从左到右体系的pH分别为：3，4，5，6，7，8。图6：不同pH下的荧光猝灭率，该荧光信号是在柠檬酸-磷酸氢二钠的缓冲溶液中，并且此时激发波长为365 nm，发射波长为645 nm左右。此时C(I2)=1mM，AuNCs稀释了300倍。由于时间会影响该体系的荧光恢复程度和稳定性，所以我们对时间进行了筛选。首先我们测定第一段反应时间，按上述方法，我们先将各种物质加入到缓冲溶液中，先让其反应不同时间，再将稀释后的BSA-AuNCs加入体系，然后测量不同时间下金纳米簇的荧光恢复程度。结果表明当铜离子催化碘离子与过硫酸盐反应30 min时，金纳米簇的荧光恢

21、复程度F/F0（F和F0分别表示体系中加Tu和不加Tu时的荧光强度）最大。所以我们确定第一段的最佳反应时间为30 min。之后我们在此条件下，测定加入BSA-AuNCs后不同反应时间的荧光发射光谱。由于在15 min后体系的荧光强度变化不大，所以我们取15 min作为第二段反应的最佳时间。如图7所示：图7：不同反应时间下的BSA-AuNCs的荧光恢复程度和荧光发射光谱。其中A指的是铜离子催化碘离子与过硫酸盐反应的时间，B指的是加入BSA-AuNCs后的反应时间。体系中C（Cu2+）=0.5 M，C(I-)=2 mM，C（K2S2O8）=0.5 mM，C（Tu）=3 M。反应物的浓度也是影响实验

22、现象的一个重要因素。该体系中，在一定时间内，随着碘离子浓度的升高，金纳米簇的荧光猝灭程度越大。同时铜离子作为催化剂，在一定时间内，铜离子浓度的大小会影响到碘离子与过硫酸盐的反应程度，从而影响BSA-AuNCs的猝灭程度，这也是本实验实现对硫脲进行定量测量的一个依据。至于过硫酸钾，尽管其作为强氧化剂本身对AuNCs荧光的抑制作用对于该体系是不利的，但是这种效应在高pH下大大降低，而且AuNCs在较高浓度的K2S2O8（如mM级别）下的猝灭程度接近于在非常少量的I2（如M水平）下的猝灭程度。由于转化的化学计量比过硫酸盐/碘为1：1，这意味着过硫酸盐部分在各种样品中呈现几乎相同的背景。同时，虽然铜离

23、子可以直接与AuNCs相互作用，但这种相互作用只对信号作出了很小的贡献，并可能被催化信号覆盖。所以所有这些因素使得铜催化反应中产生的碘对AuNCs荧光的变化起主要作用，因此铜离子浓度与荧光猝灭之间存在定量关系，硫脲加入后，通过与铜离子相互作用，使之与荧光猝灭之间形成间接的定量关系，以此实现对硫脲的定量测量（如图8所示）。所以我们只需测定铜离子浓度和碘离子浓度的影响。在pH=3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，按上述方法，加入K2S2O8、KI、Tu以及不同浓度的Cu2+，30 min后再将稀释后的BSA-AuNCs加入体系，将体系中的pH调至7，15 min后测量其荧光发射光谱，根据其荧光猝灭效

24、果，我们可以发现当C（Cu2+）=0.5 M时，金纳米簇的荧光恢复程度最大（如图9所示）。碘离子最佳浓度的的筛选过程和上述过程类似，只需调节碘离子的浓度，反应时间和pH不变，测量其荧光发射光谱。根据结果，我们将3.0 mM确定为碘离子的最佳反应浓度（如图10所示）。图8：不同pH下的荧光猝灭率，荧光强度是在加入1 mM K2S2O8的金纳米簇中测得的，并且此时激发波长为365 nm，发射波长为645 nm左右。图9：在体系中加入不同浓度的CuSO4（C=0.25 M，0.5 M，0.8 M，1.0 M，1.5 M）时的荧光猝灭率。此时C(I-)=3 mM，C（K2S2O8）=0.5 mM，C（

25、Tu）=3 M。图10：在体系中加入不同浓度的KI（C=0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0 mM，3.0mM，5.0 mM，8.0 mM，10.0 mM）时的荧光猝灭率。此时C（Cu2+）=0.5 M，C（K2S2O8）=0.5 mM，C(Tu)=3 M。在最佳的反应条件下，将Cu2+（0.5 M），K2S2O8（0.5 mM），KI（3.0 mM）以及不同浓度的Tu在pH=3的缓冲溶液中混合，反应30 min后，将稀释的BSA-AuNCs加入体系，15 min后在激发波长为365 nm时测定体系的荧光发射光谱，结果表明硫脲的浓度越高，BSA-AuNCs的荧光恢复程度越高。而且我

26、们发现BSA-AuNCs的荧光恢复程度F/F0在0.2-4.0 M范围内与硫脲浓度呈线性关系，线性相关系数是0.99229，检测限可达到0.03 M。如图11所示：图11：A是加入不同浓度硫脲后BSA-AuNCs的荧光强度光谱图；B是BSA-AuNCs的荧光恢复程度F/F0与硫脲浓度的线性关系图。2.4 BSA-AuNCs荧光探针的选择性为了检测本实验BSA-AuNCs荧光探针检测硫脲的选择性，按上述方法，我们将300 M的其他可能影响体系荧光恢复的物质，如：氯化钾（KCl），氯化钠（NaCl），甘氨酸（Gly），组氨酸（His），赖氨酸（Lys），柠檬酸（CA），以及3 M的硫脲分别先与Cu

27、2+（0.5 M），K2S2O8（0.5 mM），KI（3.0 mM）混合，30 min后，再加入稀释的BSA-AuNCs，测定各体系的荧光强度。结果表明，这些物质对BSA-AuNCs的荧光恢复没有明显影响，从而体现出BSA-AuNCs对于检测硫脲有良好的选择性。实验结果如图13所示：图13：不同物质对BSA-AuNCs-Cu2+-I-S2O82-体系的荧光恢复程度第三章 总结综上所述，我们通过荧光金纳米簇的恢复程度，建立了一种检测硫脲的分析方法。首先向金纳米簇中加入碘离子、过硫酸盐以及铜离子时，其荧光会发生明显的猝灭；如果同时加入硫脲，荧光发生恢复。通过这种方法可以实现对硫脲的定量测量，检测

28、限为0.03 M。参考文献1G.Y. Chen, I. Roy, C.H. Yang, N.P. Prasad, Nanochemistry and nanomedicine for nanoparticle-based diagnostics and therapy, Chem. Rev. 2016, 116, 2826.2Y. Wang, A. Hu, Carbon quantum dots: synthesis, properties and applications, J. Mater. Chem. 2014, 2, 6921. 3H. Liu, X. Zhang,

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