药敏试验简介

1、药敏试验简介药敏试验简介卢先雷卢先雷本节课程需要掌握的内容 什么是药敏试验，什么时候需要做药敏试验即药敏试验的临床指征是什么？ 药敏试验方法学怎么做 药敏试验结果的正确判读与解释怎么观察 药敏结果的正确报告 药敏试验的室内质量控制药敏试验的概念与适应征 通过模拟体内环境条件，测试分离自病人体内感染部位的病原菌对常用抗生素的敏感性，即抗生素对目标细菌的抑制能力，从而预测抗生素治疗效果的一种体外试验方法。 药敏试验适应征：分离菌是感染菌而不是定植菌或污染菌；常规经验治疗效果不佳或有较高失败风险时；对感染菌的耐药性无法估计时；需要了解微生物耐药性变迁时药敏试验方法学 纸片扩散法 稀释法（MIC法）

2、肉汤稀释法 常量稀释法 微量稀释法 琼脂稀释法 E-test法药敏试验方法学指南 美国CLSI M2-A10 Disk Diffusion (2009)* M7-A8 MIC (2009)* M11-A7 Anaerobes (2007) M24-A Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes M27-A2 Fungal MIC(2002) M44-A Funga Disk Diffusion(2004) M45-A Infrequently Isolated/Fastidious Bacteria (2006) 其他标准：

3、 法国CASFM标准； 梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准 英国BSAC标准； 欧洲应用比较广泛的标准 德国DIN标准 .纸片扩散法 原理 一定药物含量的碟形抗生素纸片贴在涂布一定浓度菌液的琼脂上，过夜培养后抗生素扩散到纸片周围的琼脂中，形成一定浓度区域，越靠近纸片的浓度越高，反之越低； 当低到一定程度（MIC以下）时药物无法抑制细菌的生长，从而形成界限分明的抑菌环 通过抑菌环大小与MIC值高低之间的统计学分布关系，经过回归处理可以求出细菌对某种抗生素的MIC折点范围对应的抑菌环大小值。由此可知，MIC与抑菌环大小之间存在负相关，。试验方法与条件 CLSI推荐培养基： 普通营养要求细菌使用

4、水解酪蛋白琼脂（MHA）平板 肺链使用含5%绵羊血的含血MHA 嗜血杆菌使用HTM培养基 淋球菌使用含1%生长因子（不含L-半胱氨酸）补充剂的GC培养基 平皿大小：最小90mm，通常使用150mm平板 琼脂厚度41mm 菌液浓度0.5 McF（约1.5108CFU/ml） 涂布方法：无菌棉签浸透菌液后稍微挤干，棉签与平板呈30左右的倾角密集左右来回涂布，完成一遍后旋转120后再涂，如此三次，最后绕边缘一次 纸片之间最佳间距30mm，不得低于25mm 培养温度；35；重叠时不超过3个碟子 气体环境：普通细菌大气环境；嗜血杆菌、淋球菌、肺链置CO2环境 培养时间：18小时测量方法 透射光 葡萄球菌

5、利奈唑胺苯唑西林万古霉素 肠球菌万古霉素 反射光 测量其他细菌与药物时 变形杆菌 忽略环内的迁徙生长 测量肉眼可见的明显抑菌区 忽略环边缘的微弱生长环内生长现象环内生长现象特殊处理方法 当受测抑菌环与旁边的融合时，选择完整部分测量 当受测抑菌环部分变形时，选择正常部分测量扩散法药敏影响因素 培养基 pH值7.2-7.4 营养程度（肠球菌能生长） 厚度 抗生素拮抗剂含量（用29212监控） 钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控） 菌悬液 浓度高抑菌环缩小 浓度低则扩大 细菌纯度 气体环境 普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 苛养菌

6、放普通环境生长不良，导致假敏感 培养时间 粘液性铜绿需48小时 测量方法稀释法（MIC法） MIC法：分为常量法和微量法常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法微量法：微量肉汤稀释法p简化双浓度折点法 ATB药敏p简化常规浓度分布MIC法 BD、德灵药敏p动力学计算MIC法 VITEK32、VITEK2药敏试验方法与条件 CLSI推荐培养基： 普通营养要求细菌使用补充阳离子MH肉汤 肺链使用含2%冻融马血的MH肉汤 嗜血杆菌使用HTM肉汤 厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤 淋病奈瑟菌推荐强化GC作琼脂稀释法 菌液浓度（5104CFU/ml）： 初始菌液0.5 McF（约1.5108CFU/ml）盐水稀释20

7、0倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml 双倍浓缩的MH肉汤的微孔板中（或预先用标准浓度的MH肉汤稀释后再加到微孔中） 接种后应充分混匀，但不能有气泡产生 静置培养 培养温度；35 气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2 培养时间：18小时 结果读取： 见后面的幻灯：常量稀释法药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，

8、浓度也为104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上104 cfu/ml4210.50.250.120mg/ml微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法结果读取技巧 磺胺类药物容易出现弱生长，只要满足70%以上抑菌率即可视为未生长 真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象（即低浓度孔易出现弱生长），判读时以对照孔为参照，80%的抑菌率即可视为未生长 大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中，出现的高浓度生长，而低浓度不生长现象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌悬液乳化不充分，细菌分散不足，以及药敏卡某些孔被污染 跳孔的解决方法：根据其他药理学特征类似的抗生素的敏感性以及分析其他同

9、类不同种抗生素的敏感性进行推断性修正 修正低浓度耐药 修正高浓度敏感肉汤稀释法注意事项 生长缓慢微生物（形成肉眼可见生长1周）不适合用MIC法 在肉汤中发育不良的微生物不适合用MIC 粘液性铜绿假单胞菌只能用扩散法，48小时观察结果 淋病奈瑟菌CLSI无肉汤稀释法药敏指南 注意微弱生长导致的假敏感（结果需要修正） 例如铜绿对磺胺、四环素、头孢噻肟/曲松 鲍曼不动杆菌对氨曲南 肺克、阴沟、变形杆菌对呋喃妥因稀释法药敏影响因素 培养基 pH值 7.2-7.4 营养程度 抗生素拮抗剂含量 钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5g/ml） 菌悬液（5104CFU/ml） 接种效应 浓度高MIC抬

10、高 浓度低MIC压低 细菌纯度 气体环境 所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 培养时间 真菌需48小时 奴卡菌需5天按照扩散法标准操作涂布接种贴上试条并培养15-18小时读取抑菌浓度并按标准解释药敏解释标准 CLSI标准； 全球性 每年更新 非强制性学术机构 FDA标准（全球标准） 建立在CLSI基础上 68年更新一次 官方机构，标准带有强制性 法国CASFM标准； 梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准 英国BSAC标准； 欧洲应用比较广泛的标准 德国DIN标准 .CLSI药敏解释标准 CLSI (Clinical Laborat

11、ory standard institution)药敏指南药敏指南CLSI 药敏文件 M100-S22 常见菌 (2012)* M11-A7 厌氧菌 (2007) M39-A3 积累抗菌谱(2009) M24-A 分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放线菌 M27-A2 酵母样真菌MIC法(2002) M44-A 真菌纸片扩散法(2004) M45-A 低频分离菌与苛养菌(2006) M2 (纸片法操作方法)M7 (MIC法操作方法)M100（解释标准） 作为共识标准即“参考方法” 临床实验室通常这样使用使用CLSI 方法记录采用其他方法时使用CLSI做参照方法进行比对CLSI M100-S22

12、 词汇表 I Part 1, 例如 抗生素类别抗生素亚类含盖的抗生素; 通用名青霉素类青霉素亚类青霉素青霉素酶稳定青霉素氯唑西林双氯西林甲氧西林萘夫西林苯唑西林CLSI M100-S22 词汇表 II 例如 抗生素类别抗生素缩写给药途径药物类别口服静脉滴注肌肉注射阿米卡星AN, AK, Ak, AMI, AMKXX氨基糖苷类氨苄西林AM, Am, AMPXXX青霉素类点击放大分组测试与选择性报告 在做药敏时每组中不同类药物只选用一种抗生素用于测试，药理作用特殊者单独测试，这些抗生素称为代表药物。 按CLSI规定，由FDA根据抗生素在临床实践中表现出来的安全性、有效性、和医学经济学原则将抗生素分

13、为A,B,C三组。报告时按照ABC的次序进行报告。关于抗生素分组 A组药物是首选药物，属于最经济有效，最安全的抗生素类别 B组是在A组药物无效时，或者感染不单纯需要扩展微生物覆盖范围时选用的药物，耐药性一般较A组药物低，但可能价格较贵或者安全性处于考察期内 C组药物是A组和B组药物都耐药时需要选用的备用抗生素，通常用于治疗高耐药菌株和严重的复杂性感染。耐药性最低，但价格昂贵或者安全性差 适合于治疗尿路感染的抗生素被归入U组 可考虑选择性应用但其适应症或适用范围不属于常规报告范畴的抗生素归入O组 处于考察过程中的某些新药和某些老药在扩展应用范围时归入Inv组关于代表药物 微生物室选取用于测试和报

14、告的抗生素是可以代表一类抗菌原理相同，抗菌效能相仿，抗菌谱基本一致，并且耐药机制相同的药物。即只需测试一种药物就可以推测出该类药物中其他几种药物的敏感性。 在根据药敏结果选用抗生素时只需选用效果相同的即可。关于代表药物 需要注意： 代表药物的代表作用只能针对同一类别的微生物，即位于表1A中同一框内的几个药物选取其中一个即可代表该类(或亚类)药物 如果一类中有几个药物分别位于不同框中，则说明这几个药物抗菌活性或耐药谱有所不同，需要分别测试我们如何理解“选择性报告”? 首先报告窄谱, 低毒性, 最便宜的药物 如果有下列情况，则报告其他药物: 对一线药物耐药时(A组药物) 分离菌来自特殊部位 病人对

15、一线药物过敏或不耐受 多种微生物感染混合感染 不同微生物导致的多部位感染 铜绿假单胞菌头孢他啶 8 S 环丙沙星 1 S庆大霉素 2 S哌拉西林/他唑巴坦 16 S 选择性报告选择性报告例如例如GroupBGroupB阿米卡星 8 S头孢他啶32 R 环丙沙星 1 S庆大霉素16 R亚胺配能 4 S哌拉西林/他唑巴坦 128 R妥布霉素16 R 选择性报告选择性报告例如例如铜绿假单胞菌GroupBGroupBGroupB我们应该使用分级报告规则吗我们应该使用分级报告规则吗? 是, 这个规则是经过国际医疗组织众多医务工作者一致通过的 是, 这将有助于临床医生在开处方时，将范围集中于: 窄谱抗生素

16、 低毒抗生素 廉价抗生素 也许不是如果在我们所在的医疗机构中我们能有更好的办法激励临床医生“谨慎处方” 的话粘质沙雷菌氨苄西林R头孢唑林R头孢曲松S庆大霉素S亚胺配能R哌拉西林/他唑巴坦S复方新诺明S报告偶然发现的亚胺配能耐药现象报告偶然发现的亚胺配能耐药现象(通常情况下，一通常情况下，一般实验室在哌拉西林和头孢曲松测定敏感时，不会般实验室在哌拉西林和头孢曲松测定敏感时，不会报告亚胺配能的结果（多数情况下该药是敏感的）报告亚胺配能的结果（多数情况下该药是敏感的），但需要注意如果测定出耐药时，就必须报告，但需要注意如果测定出耐药时，就必须报告) 例如：例如：金属酶？金属酶？修正为修正为R修正为修

17、正为RCLSI M100 表 1的解读注意： “方框”的含义 “或”字的含义 “警告” 评述的含义 “Rx” 评述的含义 认真阅读脚注叙述的内容表表1对于分组测试与报告推荐药物表格对于分组测试与报告推荐药物表格的注释说明的注释说明同一框中无同一框中无“或或”字相连字相连, 例如例如: 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌亚胺配能亚胺配能美罗培能美罗培能每个框中包含的多个药物 测试结果解释(S, I, R) 时类似 临床疗效类似 并且, 只需选择其中一种药物用于测试即可(当然所选的药物在你所在的机构应是恰当的)从一个药推从一个药推导到另一个药导到另一个药框中有“或”字相连的，例如: 葡萄球菌阿奇霉素 “或”

18、克拉霉素“ 或” 红霉素在一个框中各个药之间有“或”字相连 几乎具有完全相同的交叉耐药和交叉敏感 临床疗效也是相同的从一个药推衍到另一个药“或”字相连的应用实例例如: 葡萄球菌阿奇霉素 “或” 克拉霉素“或”红霉素金黄色葡萄球菌 克林霉素S 红霉素红霉素R 苯唑西林S 青霉素R 万古霉素S 耐药结果推衍耐药结果推衍实例实例推衍出阿奇霉素及克拉霉素耐药金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 克林霉素S 红霉素红霉素S 苯唑西林S 青霉素R 万古霉素S敏感结果推衍敏感结果推衍实例实例推衍出阿奇霉素及克拉霉素敏感CLSI “警告” 评述 有些药物或复合药物制剂测试结果为 “S” 但临床治疗无效 体外测试敏感但

19、体内无效的药物或药物复合制剂微生物沙门菌、志贺菌李斯特菌ESBL 阳性的肠杆菌禁止报告“S”一二代头孢头霉菌素氨基糖苷类所有头孢类氨曲南一二代头孢菌素三四代头孢修改折点的除外青霉素类体外测试敏感但体内无效的药物或药物复合制剂微生物 MRSA, MRCNS 肠球菌禁止报告“S”所有内酰胺类 头孢类 克林霉素 复方新诺明 氨基糖苷类 (高浓度除外)“警告” 评述 举例“Warning: For oxacillin-resistant staphylococci (MRS), all penicillins, cephems, carbapenems, and other -lactams such

20、 as amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin-sulbactam, ticarcillin-clavulanic acid, piperacillin-tazobactam, and imipenem may appear active in vitro but are not effective clinically. Results for these drugs should be reported as resistant or should not be reported. This is because most cases of docu

21、mented MRS infections have responded poorly to -lactam therapy, or because convincing clinical data have yet to be presented that document clinical efficacy for these agents.警告：对于MRS而言，无论你在实验中测得的结果如何，所有内酰胺类在临床治疗中均是无活性的；应该报告所有的-内酰胺类药物耐药。因为在临床治疗观察中对MRS测试“敏感”的这类抗生素不是反应差就是无令人信服的数据证明其有效性。观点的历史沿革与发展 Oxaci

22、llin-resistant staphylococci are resistant to all currently available -lactam antimicrobial agents, with the exception of the newer cephalosporins with anti-MRSA activity. Thus, susceptibility or resistance to a wide array of -lactam antimicrobial agents may be deduced from testing only penicillin a

23、nd either cefoxitin or oxacillin. Routine testing of other penicillins, -lactam/-lactamase inhibitor combinations, cephems, or carbapenems is not advised. 苯唑西林耐药葡萄球菌（MRS）对除开新型的具有抗MRSA活性的头孢菌素之外的所有-内酰胺类均耐药；对众多内酰胺类抗生素而言，只需要通过检测青霉素，与苯唑西林或头孢西丁中的任意一个即可预测其他抗生素的敏感与耐药。无须常规测试其他青霉素类、头孢类、复合制剂、碳青霉烯类。金黄色葡萄球菌头孢唑林

24、S R*克林霉素 R 红霉素 R 苯唑西林 R 青霉素 R 万古霉素 S“警告警告” 举例举例分离自脑脊液中的菌株不要报告这里所例举的任意一种药物 仅仅用于口服的药物 一二代头孢菌素(头孢呋辛钠除外) 头霉菌素类 克林霉素 大环内酯类 四环素类 氟喹诺酮类尿液中的分离菌 不要报告下列抗生素 阿奇霉素 氯霉素 克拉霉素 克林霉素 红霉素 报告CLSI M100-S22 Table 1A中位于U组的抗生素： 例如， 呋喃妥因，等。这些药物不通过肾脏排泄，因而在尿液中达不到应有浓度，对感染的治疗无贡献CLSI “Rx” 评述 该处评述（或者修订评述）的建议是针对临床医生在处方过程中应该理解并注意的，

25、微生物室应附在报告中提示医生Rx: 评述举例 Rx: 利福平在抗菌治疗中不能单独应用金黄色葡萄球菌克林霉素 R 红霉素 R 苯唑西林 R 青霉素 R利福平 S 万古霉素 SRx: 利福平在抗菌治疗中不能单独应用”“Rx” 举例举例CLSI M100-S22 解释标准覆盖的细菌类别 肠杆菌科 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌 其他非肠道杆菌 葡萄球菌属 肠球菌属 流感嗜血杆菌与副流感杆菌 淋病奈瑟菌 肺炎链球菌 -溶血链球菌 草绿色链球菌 脑膜炎奈瑟菌 厌氧菌不同细菌适用的药敏方法 部分细菌同时具有扩散法标准和MIC标准，但具有扩散法标准的药物相对较少 部分细菌（某些

26、药物）只有MIC标准 其他非肠道细菌所有药物 葡萄球菌万古霉素、托达霉素 肠球菌托达霉素 肺链除苯唑西林以外的其他内酰胺类 溶血链球菌除青霉素、氨苄青霉素、头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他内酰胺类 草绿色链球菌除头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他内酰胺类 厌氧菌所有药物 淋菌只有扩散法和琼脂稀释法，无肉汤稀释法标准表表2中没有列举的抗生素或者目前为止中没有列举的抗生素或者目前为止尚无解释标准的抗生素尚无解释标准的抗生素. 毫无疑问这些都是不用测试的 例如: 铜绿假单胞菌对头孢西丁，因为该药对铜绿是没有活性的For some organism/antimicrobial agent combination

27、s, the absence or rare occurrence of resistant strains precludes defining any results categories other than “susceptible.” For strains yielding results suggestive of a “nonsusceptible” category, organism identification and antimicrobial susceptibility test results should be confirmed.对于某些细菌而言，某些抗生素敏

28、感以外的结果是不存在或罕见的；当产生不敏感结果时，其鉴定或药敏结果应该经过其他途径确认 肺炎链球菌- 万古霉素 MIC (g/ml) 敏感 中介 耐药万古霉素 1.0 - - *研究任何产生不敏感结果的菌株研究任何产生不敏感结果的菌株CLSI M100 S22包含的其他信息 特殊耐药机制检测方法 推荐给药方案 质控方案 天然耐药谱 不常见耐药表型介绍以及确认方法 脆弱拟杆菌抗生素积累敏感性（统计） 其他厌氧菌抗生素积累敏感性（统计） 质量管理系统简介少见菌和苛养菌的特殊药敏参考方法：参考方法：M45-A 乏养菌与颗粒链菌稀释法 嗜水气单胞菌复合群稀释法与扩散法 弧菌属细菌（霍乱除外）稀释法与扩

29、散法 芽孢杆菌属（炭疽除外）稀释法 空肠/大肠弯曲菌稀释法与扩散法 棒状杆菌稀释法（可用的药物标准比BSAC标准提供的多）Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria；Approved guideline 猪红斑丹毒似菌稀释法 HACEK组苛养性G-杆菌稀释法 卡他莫拉菌稀释法 产单核细胞李斯特菌稀释法 巴斯德菌稀释法 其他，如乳杆菌、片球菌、无色藻菌稀释法分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放线菌药敏参考方法：M

30、24-A 结核分枝杆菌复合群比例法 缓慢生长非结核分枝杆菌稀释法 快速生长分枝杆菌稀释法 奴卡菌等需氧放线菌稀释法Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard真菌药敏 M27-A2用于酵母样真菌的稀释法药敏只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解释标准，其他药物的测试结果报告MIC M44-A用于酵母样真菌的扩散法药敏只有氟康唑有解释标准 M38-P用于丝状真菌的稀释法药敏只有操作方法，报告MIC值，但无解释标准药敏试验质量控制 意义：保障药敏

31、结果的可靠性准确性和精密度 控制环节（重要的五大环节）： *质控1：人员操作能力 质控2：菌液浓度（比浊） 质控3：培养基质量 质控4：药敏试剂（纸片或MIC试卡/板）、读取药敏结果的仪器设备 *质控5：异常结果的发现与修正 参照指南：CLSI文件*质控1：人员 标准操作指南：扩散法参照CLSI-M2文件；MIC法参照M7文件 考核内容：基本操作步骤的熟练程度结果的正确读取人员：操作步骤的熟练程度 按照标准程序操作，能在15分钟内完成单个分离菌的药敏试验操作 操作过程： 菌落的挑取手法 菌液的配制操作与菌液混匀操作 扩散法中菌液涂布操作 MIC法中菌液的稀释操作 仪器法中仪器的标准操作手法 菌

32、悬液纯度和浊度的验证性操作；人员：结果的正确读取 抑菌环的正确测量忽略边缘的微弱生长 环内生长的检测污染菌的发现或耐药亚群的分离确认 MIC值的正确读取 包括跳孔现象的发现与纠正 微弱生长孔的发现与结果修正（磺胺、四环、氯霉素、氨曲南） 拖尾现象的正确忽略（磺胺、真菌） 生长不良的确认与补救措施（重做、延长）质控2：菌液浊度控制 目测法控制 内容：主要是0.5McF浊度的感知能力 参照物：0.5 McF硫酸钡比浊管，对应1.5108 CFU/ml 参考方法：菌液稀释后菌落计数法 允许误差：1.5107 1.5109 CFU/ml 仪器法控制 内容：同上 校准品：0.54 McF硫酸钡比浊管 参

33、考方法：同上 允许误差：同上质控3：MH培养基质量控制 pH值 7.2-7.4 营养程度：不加血的情况下就能支持ATCC 29212的生长 抗生素拮抗剂含量：使用ATCC 29212监测，扩散法有抑菌环出现，并且环内只允许微量小菌落出现；MIC法抑菌率80% 钙镁离子含量：钙10-25、镁10-12.5g/ml 锌离子含量：ATCC27853亚胺配能结果在允许范围内质控4：药敏试剂质控 CLSI提供扩散法和稀释法的质控标准 扩散法标准适合于纸片扩散法 稀释法标准适合于微量肉汤稀释法、琼脂稀释法，以及E-test法 内容 标准菌株 质控频率 各种药物的控制范围扩散法质控 菌株 非苛养菌：肠杆菌科ATCC 25922 大肠；非发酵菌27853 铜绿；葡萄球菌25923 金葡；加酶抑制剂抗生素质控35218 产ESBL大肠 苛养菌：嗜血杆菌49247 流感，49766 流感用于补充，弥补49247某些不能检测的药物；淋菌用49226；肺链用49619扩散法控制范围点击放大稀释法质控 菌株 非苛养菌：肠杆菌科25922；葡萄球菌29213；肠球菌29