色谱法的基本原理

1、 第二章第二章 色谱法的基本原理色谱法的基本原理Principles of ChromatographyPrinciples of Chromatography 本章基本要求本章基本要求 理解混合物中各组分在色谱柱内分离的原因；理解混合物中各组分在色谱柱内分离的原因； 了解色谱流出曲线和术语；了解色谱流出曲线和术语； 理解柱效率的物理意义及计算方法；理解柱效率的物理意义及计算方法； 理解速率理论方程对实际分离的指导意义；理解速率理论方程对实际分离的指导意义； 掌握分离度的计算方法及影响分离度的色谱参数。掌握分离度的计算方法及影响分离度的色谱参数。2.1 概概 述述2.1.1 色谱法发展史色谱法

2、发展史 色谱法是俄国植物学家色谱法是俄国植物学家Tswett（茨维特）于（茨维特）于1903年首先年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根装有固体提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根装有固体碳酸钙颗粒（固定相）的竖直玻璃管（色谱柱）中，并再碳酸钙颗粒（固定相）的竖直玻璃管（色谱柱）中，并再从管的上部加入纯的石油醚（流动相），任其自由流下。从管的上部加入纯的石油醚（流动相），任其自由流下。这时植物色素的抽提液沿玻璃管流动，在管内形成具有不这时植物色素的抽提液沿玻璃管流动，在管内形成具有不同颜色的色带，每个色带代表不同的组分。同颜色的色带，每个色带代表不同的组分。 - “色谱色谱”（

3、色层）因而得名（色层）因而得名 色谱法：色谱法：借助在两相间分配系数的差异，而使混合物中各组借助在两相间分配系数的差异，而使混合物中各组分获得分离的技术称为色谱分离技术。分获得分离的技术称为色谱分离技术。 固定相：固定相：填充柱内的填料（固体或液体）。填充柱内的填料（固体或液体）。 流动相：流动相：携带样品流过固定相携带样品流过固定相 (气体、液体和超临界流体气体、液体和超临界流体)。 色谱柱：色谱柱：装有固定相的柱。装有固定相的柱。 色谱分离过程：色谱分离过程：当流动相中携带混合物经过固定相时，与固定当流动相中携带混合物经过固定相时，与固定相发生作用，由于各组分的结构性质（溶解度、极性、蒸汽

4、压相发生作用，由于各组分的结构性质（溶解度、极性、蒸汽压和吸附能力等）不同，这种相互作用产生强弱的差异。在同一和吸附能力等）不同，这种相互作用产生强弱的差异。在同一推动力的作用下，不同组分在固定相推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间滞留时间长短不同，按先长短不同，按先后不同的次序从固定相中流出。后不同的次序从固定相中流出。几个基本术语：几个基本术语：气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱 液液-固固 色谱色谱气气-液液 色谱色谱 柱色谱柱色谱：固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色：固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱。固定相装在色谱柱（玻璃管或毛细谱和毛细管柱色谱。固定相装在色谱

5、柱（玻璃管或毛细管）内。管）内。 纸色谱纸色谱：用滤纸作固定相或载体，把试样液体滴在：用滤纸作固定相或载体，把试样液体滴在滤纸上，用溶剂将它展开，根据其在纸上有色斑点的位滤纸上，用溶剂将它展开，根据其在纸上有色斑点的位置与大小，进行鉴定与定量测定。置与大小，进行鉴定与定量测定。 薄层色谱薄层色谱：将固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。：将固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。样品的分离形式类似纸色谱。样品的分离形式类似纸色谱。在液在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性不同，又分为正相分配色谱和反向分配色谱。性不同，又分为正相分配色谱和反向分配色谱。固定相是一

6、种分子筛或凝胶，利用各固定相是一种分子筛或凝胶，利用各组分的分子体积大小不同而进行分离的方法。组分的分子体积大小不同而进行分离的方法。 ：利用不同组分与固定相的高专属性亲合力进行分离：利用不同组分与固定相的高专属性亲合力进行分离的技术，常用于蛋白质的分离。的技术，常用于蛋白质的分离。色谱法的分类大致如下：色谱法的分类大致如下： 根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中：根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中：msCCK KVVKVCVCnnmmkmsmmssmsmssmVV：相比：相比进样进样A AB B空气空气B BA AA+BA+B流动相流动相B BB BA A流动相流动相固定相固定相检

7、测和纪录检测和纪录色谱流出曲线（色谱图）即色谱柱流出物通过检测色谱流出曲线（色谱图）即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。为信号强度，横坐标为保留时间。峰高峰高 色谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）响应值响应值1、 有关术语有关术语死时间死时间tm : 不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱柱时，从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。柱时，从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。对于气相色谱，常把空气对于气相色谱，常把空气(TCD)和甲烷和甲烷(FID)从进样从

8、进样到出峰的时间称为到出峰的时间称为tm。如图中。如图中O-A。这种物质不被。这种物质不被固定相吸附或溶解，其流速与流动相的流速接近。固定相吸附或溶解，其流速与流动相的流速接近。测定流动相平均线速度测定流动相平均线速度 时可用柱长时可用柱长L与死时间与死时间tm 的的比值计算。比值计算。m Lutm Ltu2、 保留值保留值保留时间保留时间 t tR R 试样从进样开始到柱后出现色谱峰极大值所需要时间。如图中试样从进样开始到柱后出现色谱峰极大值所需要时间。如图中O-B。它相应于样品到达检测器所需的时间。它相应于样品到达检测器所需的时间。 tR = tR+ tm调整保留时间调整保留时间t tR

9、R 扣除死时间后的组份保留时间，扣除死时间后的组份保留时间， 即即 tR = tR tm 组分在色谱柱中的保留时间组分在色谱柱中的保留时间t tR R包含了组分随流动相通过柱子所需的包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留的时间；时间和组分在固定相中滞留的时间；t tR R实际上是组分在固定相中实际上是组分在固定相中滞留的时间。单位滞留的时间。单位(s)(s)或或(cm)(cm)。死体积死体积 V Vm 不能被固定相滞留的（惰性）组分从进样到出现峰不能被固定相滞留的（惰性）组分从进样到出现峰最大值时所消耗的流动相的体积。死体积可由死时间最大值时所消耗的流动相的体积。死体积可由死

10、时间与流动相体积流速与流动相体积流速F F0 0（L Lminmin）计算：）计算： V Vm = = t tmF F0 0保留体积保留体积 V VR R 从进样开始到柱后被测组份出现浓度最大值时所通从进样开始到柱后被测组份出现浓度最大值时所通过的流动相体积。如下：过的流动相体积。如下： V VR R = = t tR RF F0 02222 1111RRR,RRR tVttVt调整保留体积调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积 VR= tRF0 或或 VR = VR - Vm相对保留值相对保留值2,1 某组份

11、某组份2与组份与组份1的调整保留值之比，是一个无因次量。的调整保留值之比，是一个无因次量。2,1的大小与两组分的的大小与两组分的选择性选择性有关。有关。2,1越大，选择性越好，越大，选择性越好，越容易分离。越容易分离。2,1只与只与柱温柱温及及固定相固定相的性质有关，而与柱径、的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此是色谱法中，特柱长、填充情况及流动相流速无关。因此是色谱法中，特别是气相色谱法中广泛使用的定性数据。别是气相色谱法中广泛使用的定性数据。 从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： 根据色谱峰个数，可以判断样品中所含组份的最少

12、个根据色谱峰个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。数。 根据色谱峰的保留值（或位置），可以进行定性分析。根据色谱峰的保留值（或位置），可以进行定性分析。 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。能的依据。 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相和流动相)选择是选择是否合适的依据。否合适的依据。在每块塔板上气液平衡是瞬间建立的。在每块塔板上气液平衡是瞬间建立的。载气以脉冲式载气以脉冲式(塞子式塞子式)进入色谱柱进

13、行冲洗，每次恰好为一个塔进入色谱柱进行冲洗，每次恰好为一个塔板体积。板体积。在所有塔板上同一组分的分配系数是常数，和组分的量无关。在所有塔板上同一组分的分配系数是常数，和组分的量无关。柱分成几段，柱分成几段，n为理论塔板数，每段高为为理论塔板数，每段高为H，柱长为，柱长为L，n=L/H。w=1g1V2V3V4V 这一理论得到结果：这一理论得到结果： 1分布有一最大，两边逐渐减小；分布有一最大，两边逐渐减小； 2最大及整个分布曲线向后推移；最大及整个分布曲线向后推移； 3流出曲线方程流出曲线方程 (也称塔板理论方程也称塔板理论方程)，即，即数学表达式：数学表达式：2R2RR()22CeN VVN

14、 mVV C：不同流出体积时的组分浓度：不同流出体积时的组分浓度m：进样量：进样量 VR：保留体积：保留体积N：塔板数：塔板数 V ：流出体积：流出体积SV(t,x)被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间或时间)的变的变化曲线：化曲线：在气相色谱柱内，理论塔板数一般达在气相色谱柱内，理论塔板数一般达10103 310106 6。塔板数越多，。塔板数越多，其流出曲线越接近于正态分布。根据塔板理论可以导出其流出曲线越接近于正态分布。根据塔板理论可以导出N N 与与色谱峰半宽度或峰底宽度的关系：色谱峰半宽度或峰底宽度的关系：理论塔板高度理论塔板高

15、度H H： LHN216R tNY 色谱峰色谱峰WW 越小，越小，N N 越大，越大，H H 越小，柱效能越高。因此，越小，柱效能越高。因此，N N 和和H H 是描述是描述柱效能柱效能的指的指标。标。 在实际工作中，计算出来在实际工作中，计算出来的的N N 和和H H 值时值时, ,有时并不能充分有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为用地反映色谱柱的分离效能，因为用t tR R计算时，没有扣除死计算时，没有扣除死时间时间t tmm，应予扣除。，应予扣除。所以用所以用t tR R代替代替t tR R 计算出来的计算出来的N N 值称为值称为有效理论塔板数有效理论塔板数N Neffeff。

16、为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数N Neffeff和有效塔板高度和有效塔板高度H Heffeff。有效塔板数。有效塔板数N Neffeff和有效塔板高度和有效塔板高度H Heffeff消除了死体积消除了死体积影响，较影响，较真实的反映了色谱柱的好坏。真实的反映了色谱柱的好坏。 221 25 5416RReff/.()()ttNYY有效塔板高度：有效塔板高度：根据根据t tR R= = t tR R- - t tmm，k k = = t tR R/ / t tm m ，t tR R = = t tmm(1+(1+k k) )，可得，可得effeff

17、 LHN2eff1 kNN+ k 塔板理论的塔板理论的成功与局限成功与局限 成功成功 导出流出曲线数学表达式导出流出曲线数学表达式(模型模型)； 解释了流出曲线形状、浓度极大点；解释了流出曲线形状、浓度极大点； 提出了评价柱效的参数提出了评价柱效的参数(N)及其计算公式。及其计算公式。 局限局限 仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素； 不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理；不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理； 不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时N和和H不同。不同。速率理论速率理论 1956年荷

18、兰化学家年荷兰化学家Van Deemter等在研究气等在研究气-液色谱时，液色谱时，讨论扩散传质等与色谱过程物料平衡和质量平衡的关系，讨论扩散传质等与色谱过程物料平衡和质量平衡的关系，考察溶质通过色谱体系总浓度的变化。他提出了色谱过考察溶质通过色谱体系总浓度的变化。他提出了色谱过程动力学理论程动力学理论速率理论速率理论。随后。随后Giddings吸收了塔板吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，认为把色谱过程看作分子和传质过程，认为把色谱过程看作分子无规则运动的随无规则运动的随机过程机过程，从而在动力学基础上较好地解

19、释了影响板高的，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。各种因素。 该理论模型对气相、液相色谱都适用。该理论模型对气相、液相色谱都适用。 Van DeemterVan Deemter方程的数学简化式为方程的数学简化式为: :BH = A+Cuu式中：式中：u为流动相的线速度；为流动相的线速度；A，B，C为常数为常数A涡涡流扩散项系数流扩散项系数B纵向分子扩散项系数纵向分子扩散项系数C传质阻力项系数传质阻力项系数（ C C s C m)。其中。其中C s：固定相传质阻力项系数；固定相传质阻力项系数； C m：流动相传质阻力项系数。：流动相传质阻力项系数。 A AB B分子扩散项分子扩散

20、项B/u Cgu -气相传质阻力项；气相传质阻力项；Cg-气相传质阻力系数气相传质阻力系数;Clu -液相传质阻力项；液相传质阻力项； Cl-液相传质阻力系数液相传质阻力系数C u = Cg u + Cl u (Cg+ Cl )u 气相传质过程：气相传质过程：气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效。小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效。液相传质过程：液相传质过程：减小液膜厚度，增大组分在液相中的扩散减小液膜厚度，增

21、大组分在液相中的扩散系数，均可提高柱效。系数，均可提高柱效。 速率理论的要点速率理论的要点 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气造成的分子扩散及传质阻力使气-液两相间分配平衡不能瞬液两相间分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。气流速可提高柱效。 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指速率理论为色谱分离和操作条件

22、的选择提供了理论指导，阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。导，阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。因此，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。散的影响。因此，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。 速率理论 液相色谱法（P19）一、定义一、定义分离度是两色谱峰分离的程度。分离度是两色谱峰分离的程度。

23、图中：图中：a）两色谱峰距离近并且峰形宽。）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，表示选择性和柱两峰严重相叠，表示选择性和柱效都很差。效都很差。b）两峰距离拉开，但峰形仍很宽，）两峰距离拉开，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。说明选择性好，但柱效低。c）分离最理想，说明选择性好，）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。柱效也高。tR（2） ，tR（1） ：两组分保留时间：两组分保留时间Y 1，Y2 ：两组分色谱峰峰底宽度：两组分色谱峰峰底宽度分离度分离度Rs单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引入一个综合性指标。分

24、离度是既能反映故需引入一个综合性指标。分离度是既能反映柱效率柱效率又能反又能反映映选择性选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值。总和之半的比值。1221211212)2( RRRRttttRYYYY同一色谱柱在相同条件下，不同组分可有不同的同一色谱柱在相同条件下，不同组分可有不同的Rs值。值。若峰形对称且满足正态分布条件，当若峰形对称且满足正态分布条件，当 Rs = 1时，分离程度时，分离程度可达到可达到98%； Rs =

25、 1.5时，分离程度可达到时，分离程度可达到99.7%，通常用，通常用Rs = 1.5作为相邻两色谱峰完全分开的标志。作为相邻两色谱峰完全分开的标志。两个相邻组分达到完全分离的条件：两个相邻组分达到完全分离的条件： （1）两色谱峰间有一定距离；）两色谱峰间有一定距离； （2）两色谱峰宽必须窄。）两色谱峰宽必须窄。Rs = 0.75Rs = 1.0Rs = 1.5s2121122)112(4 RRRRkkttttNRYYYY1 = Y2二、色谱分离方程式及影响分离度的因素二、色谱分离方程式及影响分离度的因素两个相邻组分达到完全分离的条件：两个相邻组分达到完全分离的条件： 两色谱峰间有一定距离，热力学因素。两色谱峰间有一定距离，热力学因素。 两色谱峰宽必须窄，动力学因素。两色谱峰宽必须窄，动力学因素。 在色谱分析中，一般选一对在色谱分析中，一般选一对难分离物质难分离物质确定分离度。确定分离度。对于难分离物质对，近似把两组分峰底宽看成一样。对于难分离物质对，近似把两组分峰底宽看成一样。222221()16() () ()11116()1= 22sseffeffkkkRkkRkNNNN(1) 色谱柱效色谱柱效 N Rs与成正比。当固定相确定后，要使相邻组分的分离与成正比。当固定相确定后，要使相邻组分的分离达到某一达到某一Rs值，柱必须具有最低限度