基因工程概念

1、基因工程概念15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念 一、基因工程的概念：一、基因工程的概念： 利用利用DNADNA体外重组或体外重组或PCRPCR扩增技术从某种生物基因组中扩增技术从某种生物基因组中 别离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然别离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然 后经过一系列切割，加工修饰，连接反响形成重组后经过一系列切割，加工修饰，连接反响形成重组DNADNA分分 子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过 程程. .基因工程基因工程(gene engineering)(gene eng

2、ineering)常和以下名称混用常和以下名称混用遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique)克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念二、基因工程的主要内容或步骤二、基因工程的主要内容或步骤1 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消

3、化或PCRPCR扩增等步骤，扩增等步骤，别离出带有目的基因的别离出带有目的基因的DNADNA片段。片段。2 2、在体外，将带有目的基因的外源、在体外，将带有目的基因的外源DNADNA片段连接到能够自我复制的并具片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组有选择记号的载体分子上，形成重组DNADNA分子。分子。3 3、将重组、将重组DNADNA分子转移到适当的受体细胞分子转移到适当的受体细胞( (亦称寄主细胞亦称寄主细胞) )，并与之一，并与之一起增殖。起增殖。4 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNADNA分子的受体细胞分子

4、的受体细胞克隆。克隆。5 5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。供进一步分析研究使用。6 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。功能表达，产生出人类所需要的物质。15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念三、三、基因工程的应用医药：医药： 生物制药；基因治疗；人工器官生物制药；基因治疗；人工器官农业和畜牧业农业和畜牧业 转基因植物：抗病虫害新品种、

5、抗逆新品种、转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、 高品高品质新品种质新品种 转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品 生物反响器：利用动植物细胞或组织作为生物反响器，生物反响器：利用动植物细胞或组织作为生物反响器，直接生产有用蛋白质直接生产有用蛋白质轻工与食品轻工与食品 新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶 环境环境 污染治理；废物利用；污染物生物降解污染治理；废物利用；污染物生物降解15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念供 体 细 胞目 的 基 因载 体重 组 D N A分 子转 化 细 胞受

6、体 细 胞多 肽 药 物疫 苗 、 抗 体基 因 治 疗基 因 诊 断 转 基 因 动 物(畜 牧 业 、 渔 业 生 物 反 应 器 )转 基 因 植 物(农 业 、 林 业 生 物 反 应 器 )冶 金 、 环 保轻 工 、 食 品15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念转基因植物转基因植物15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念转基因动物作转基因动物作为生物发生器为生物发生器15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNADNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子

7、的甲基化 核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 一、限制性内切酶 一、限制修饰系统的种类一、限制修饰系统的种类 二、限制性内切酶的定义、命名二、限制性内切酶的定义、命名 三、限制酶的特点三、限制酶的特点 四、异源同序酶四、异源同序酶isoschizomer，同裂酶，同裂酶 五、限制酶的用途五、限制酶的用途15.2 15.2

8、基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶一种限制酶只一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列；能识别一种特定核苷酸序列；并并在特定在特定切点切割切点切割限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀 来源：来源： 种类：种类： 作用：作用：主要是微生物主要是微生物40004000种。种。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶一、限制修饰系统的种类一、限制修饰系统的种类1.1. 型：由三个基因构成，型：由三个基因构成，hsdRhsdR；hsdMhsdM；hsdShsdShost specificity host specificity for DNA restriction m

9、odification and specificityfor DNA restriction modification and specificity位于染色位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATPATP、Mg2+Mg2+、SAMSAM腺苷甲硫氨酸，无特异切割位点。腺苷甲硫氨酸，无特异切割位点。2.2. 型：限制与修饰基因产物独立起作用，在型：限制与修饰基因产物独立起作用，在. coli. coli中这两种基因位于中这两种基因位于质粒上。质粒上。3.3. 型：修饰酶与型酶相同，型：修饰酶与型酶相同，hsdhsd与与hsdhsd基因产物结合成

10、一亚单位，基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有IIII型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶二、限制性内切酶的定义、命名二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指狭义指型限制酶。型限制酶。 2. 命名：限制酶由三局部构成，即菌种名、菌系编号、别命名：限制酶由三局部构成，即菌种名、菌系编号、

11、别离顺序。离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“表示别离到的第三个限制表示别离到的第三个限制酶。酶。 EcoRIEscherichia coli RI 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶三、限制酶的特点三、限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点 识别识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸 MboI NGATCN； AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC： PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； Sf

12、iI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG 富含富含 对称性对称性双对称双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 切点大多数在识别顺序之内，也有例外切点大多数在识别顺序之内，也有例外 限制酶切后产生两个末端，末端结构是限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 2. 2. 末端种类末端种类 - -端突起，个数为或个核苷酸端突起，个数为或个核苷酸 Pst I 5 Pst I 5-CTGCAG-3-CTGCAG-3 5 5-CTGCA G-3-CTGCA G-3 3 3-

13、GACGTC-5-GACGTC-5 3 3-G ACGTC-5-G ACGTC-5 - -端突起，个数为或个核苷酸端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5 EcoRI 5-GAATTC-3-GAATTC-3 5 5-GOH PAATTC-3-GOH PAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 3 3-CTTAAP HOG-5-CTTAAP HOG-5 粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别 位点的位点的DNADNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组D

14、NADNA分子。在进行分子。在进行 DNA DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNADNA，使之产生相对的粘，使之产生相对的粘 性末端，然后再将二者连接成重组性末端，然后再将二者连接成重组DNADNA分子分子15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 EcoR 5- G-A-A-T-T-C-3 3- C-T-T-A-A-G-5 Palindrome 5 5-GOH PAATTC-3 3 3 3-CTTAAP HOG-5 5Cohesive Ends (Sticky Ends)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具

15、酶SmaI 5 5-CCCGGG-3 3 5 5-CCC GGG-3 3 3 3-GGGCCC-5 5 3 3-GGG CCC-5 5Blunt Ends15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 平齐末端平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 非互补的粘性末端非互补的粘性末端 切点在识别顺序之外的，如：切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 能识别简并顺序的，如：能识别简并顺序的，如：AvaI A

16、vaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶四、异源同序酶四、异源同序酶isoschizomerisoschizomer，同裂酶，同裂酶 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶或多种限制酶 2. 特点：特点：1识别相同顺序识别相同顺序 2切割位点的异同切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶五、五、

17、 限制酶的用途限制酶的用途 1. DNA重组重组 2. 限制酶物理图谱绘制限制酶物理图谱绘制 3. 突变分析突变分析RFLP分析分析 4. 限制酶的局部酶切与完全酶切限制酶的局部酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点 1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。 2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反响。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反响。 4. 产生粘性末端可以是产生粘性末端可以

18、是1-5个核苷酸。个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108 kD。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶Restriction Maps (a)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶Restriction Maps (b)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE15.2 15.2 基因工程中的工具酶

19、基因工程中的工具酶二、二、DNADNA聚合酶聚合酶一、一、E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶I Ipol pol 1. E.coli 1. E.coli 的的DNADNA聚合酶系统聚合酶系统 Pol Pol 参与参与DNADNA修复修复, , 具具3 355和和5 533外切酶活外切酶活性性 pol pol 同上同上 具具3 355外切酶活性外切酶活性 pol pol 参与参与DNADNA复制复制, , 具具3 355和和5 533外切酶活性外切酶活性 2. E.coli pol 2. E.coli pol的特点的特点 1 1具两种外切酶活性和具两种外切酶活性和DNADNA聚

20、合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具成两个大小不同的片段，其中小片段具5 533外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具3 355外切酶活性外切酶活性( (大片段亦称为大片段亦称为KlenowKlenow片段片段, polIK), polIK) 2 2 聚合酶活性，聚合酶活性，5 533, , 要求要求3 3-OH-OH引物和模板引物和模板DNADNA，其延续性受，其延续性受反响条件的影响反响条件的影响 3 3 外切酶活性外切酶活性 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 3. 3. 用途用途 1 1 除去除

21、去3 3- -端突起的单链端突起的单链DNADNA在无在无dNTPdNTP时时 2 2 补齐补齐5 5- -突起端突起端 3 3 合成第二条合成第二条cDNAcDNA 4 4 切口移位制备探针切口移位制备探针 其中用途其中用途2) 2) 和和3)3)常用大片段常用大片段15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶三、连接酶一、一、T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 1. 1. 特点：特点： 只连接只连接ds -DNAds -DNA分子，要求分子，要求3 3- -羟基和羟基和5 5- -磷酸基磷酸基 2. 2. 用途：用途： 1) 1) 相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的

22、连接 2) 2) 平整末端的相连平整末端的相连 DNA DNA平端来源：限制酶作用结果平端来源：限制酶作用结果; ; 限制酶与其它酶共同作限制酶与其它酶共同作用结果用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多酶量也多 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或

23、或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA连接酶连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 T4 DNAT4 DNA连接酶的连接反响连接酶的连接反响( (两种插入方向两种插入方向) ) +The polymerase chain reaction (PCR)：to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each complementary to

24、 one end of the the DNA target sequence. 1985年，美国年，美国Cetus 公司和加利福尼亚大学联合创立了公司和加利福尼亚大学联合创立了一种核酸体外扩增技术。一种核酸体外扩增技术。15.315.3 Polymerase Chain Reaction Denaturation 变性变性: The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95 Primer annealing 引物退火引物退火: The temperature is reduced to around

25、 55 to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg+15.315.3 Polymerase Chain Reaction15.4 15.4 Vectors 一、质粒的一般生物学特性； 二、质粒DNA的别离与纯化； 三、质粒载体的构建及类型； 四、常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性一、质

26、粒的一般生物学特性一、质粒一、质粒DNADNA1 1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNADNA分子。分子。2 2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R R质粒。质粒。R R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。2 2、质粒、质粒DNADNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染

27、色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3 3、质粒、质粒DNADNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4 4、环形双链的质粒、环形双链的质粒DNADNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNADNA

28、cccDNAcccDNA，开，开环环DNADNAocDNAocDNA，线性，线性DNADNAcDNAcDNA，具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶，具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。电泳中分开。二、质粒的拷贝数与不亲和性二、质粒的拷贝数与不亲和性1 1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒拷贝根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒拷贝数少，为数少，为1-51-5个与松弛型复制质粒拷贝数多，可达个与松弛型复制质粒拷贝数多，可达10-200

29、10-200份拷贝。因此，作份拷贝。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。为载体的质粒应该是松弛型的。2 2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥稀释掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。必然有一种会被逐渐地排斥稀释掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。15.4 15.4 Vectors二、质粒二、

30、质粒DNADNA的别离与纯化的别离与纯化15.4 15.4 Vectors三、质粒载体的构建及类型三、质粒载体的构建及类型 一质粒载体的开展概况；一质粒载体的开展概况； 二质粒载体的特点根本条件；二质粒载体的特点根本条件； 三遗传标记基因三遗传标记基因 四质粒载体的类型四质粒载体的类型15.4 15.4 Vectors一开展概况一开展概况 1. 第一阶段第一阶段1977年前：天然质粒和重组质粒的利用，如年前：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：增大载体容量降低载体长度，建立

31、多克隆位点区和新的第二阶段：增大载体容量降低载体长度，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如遗传标记基因。如pUC系列载体。系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。型载体。 15.4 15.4 Vectors二载体特点二载体特点1、 至少有一个复制起点，因而至至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。少可在一种生物体中自主复制。2、 至少应有一个克隆位点，以供

32、外至少应有一个克隆位点，以供外源源DNA插入。插入。3、 至少应有一个遗传标记基因，以至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组指示载体或重组DNA分子是否进分子是否进入宿主细胞。入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的、具有较小的分子量和较高的拷贝数。拷贝数。注：前三个特点必不可少注：前三个特点必不可少。p pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )三遗传标记基因三遗传

33、标记基因1、 标记基因的作用标记基因的作用 1指示外源指示外源DNA分子载体或重组分子是否进入宿主细胞分子载体或重组分子是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的这种指示可以是选择性的Ampr ，Tetr ，Kanr，也可以，也可以是非选择性的如是非选择性的如lacZ 2指示外源指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的如这种指示也可以是选择性的如TcS，也可以是非选择性的如，也可以是非选择性的如TcS， lacZ，绝大多数为后者。，绝大多数为后者。 *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好有的遗传标记基

34、因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的检测性检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因lacZ等。等。2 2、 标记基因的种类标记基因的种类 1 1抗性标记基因可直接用于选择转化子抗性标记基因可直接用于选择转化子 主要是抗生素抗性基因主要是抗生素抗性基因: Ampr : Ampr ，Tetr Tetr ，CmlrCmlr，KanrKanr，StrrStrr 2 2生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反响，如

35、其表达产物可催化某些易检测的生化反响，如lacZlacZ3 3、常用的遗传标记基因及其作用机制、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 1) 四环素抗性基因四环素抗性基因 Tetr Tetr ，TcrTcr Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种环素抗性基因编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 2) 氨苄青霉素抗

36、性基因氨苄青霉素抗性基因 Ampr Ampr ，AprApr Ampicillin Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。壁合成酶类的活性。AprApr抗性基因编码一种分泌到细抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 Cmlr ，Cmr Chlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白亚基上，阻止蛋白质合成。质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素

37、乙基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 卡那霉素卡那霉素(Kanr), 新霉素新霉素(Neor)和和G418抗性抗性(G418r)基因基因 Kanamycin，Neomycin和和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。细胞内。5半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ 和和lacZ 半乳糖苷酶

38、基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两局部：酶活。该蛋白质可分为两局部：链和链和链。前者负责四聚体装配，链。前者负责四聚体装配，后者具后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为活性，该作用称之为-互补作用。这两个局部可独立存在，互补作用。这两个局部可独立存在， 分别由分别由两个基因编码。为两个基因编码。为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZ(编码编码145 AAs)。这两。这两个基因个基因LacZ和和LacZ均可作为标记基因。均可作

39、为标记基因。 lacZlacZ中含有多克隆位点，当无外源中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表片段插入时，质粒表达达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌不能编码肽，与缺失突变体宿主菌不能编码-肽表达的肽表达的lacZ基因产物基因产物 链互补，产生有活性的链互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示半乳糖苷酶，在含有指示剂剂X-gal和诱导剂和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了坏了lacZ -肽基因的结构，细菌内不能产生肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。白色。

40、半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码编码5-端可容许很大的变化如参加多克隆位点而不影响端可容许很大的变化如参加多克隆位点而不影响酶活性酶活性 c. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大 P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻译 LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物pUC18 BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap

41、的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子四、质粒载体的类型1 1、根据载体的分子生物学特性划分、根据载体的分子生物学特性划分 1 1. . 质粒型载体质粒型载体环状环状dsDNAdsDNA分子，自主复制分子，自主复制 2 2. . 病毒型载体病毒型载体环状、线状、环状、线状、ss-ss-和和ds-DNAds-DNA分分子，形成病毒颗粒子，形成病毒颗粒 3 3. .混合型载体混合型载体具质粒和病毒特性，特性的具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性转换依赖于宿主细胞生物学特性 15.4 15.4

42、 Vectors2 2、根据载体功能划分、根据载体功能划分 1 1. . 普通型载体普通型载体 1) 1) 特点特点: : 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。 2) 2) 用途用途: : 基因组或基因组或cDNAcDNA文库的构建文库的构建; ;次克隆次克隆(subcloning)(subcloning)或限制酶谱分析；外源或限制酶谱分析；外源DNADNA扩增。扩增。 例子例子: pBR322: pBR322和和pUCpUC载体。载体。 上述两例中的非重组

43、子来源有两个：上述两例中的非重组子来源有两个： a. a. 酶切反响时仍未被作用的酶切反响时仍未被作用的pBR322pBR322或或pUC18pUC18分子分子 b. b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子15.4 15.4 Vectorsp pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )EcoSacKpnSmaBamXbaSa

44、lPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19载体载体普通型载体普通型载体pBR322的结构的结构图图2 2、表达型载体、表达型载体expression vectorexpression vector 1) 1) 特点特点: : a. a. 基因的启动子序列和终止子序列；基因的启动子序列和终止子序列； b. b. 一般无检测标记基因；一般无检测标记基因； c. c. 克隆位点是确定的即

45、位于启动子序列后；克隆位点是确定的即位于启动子序列后； d. d. 重组分子用凝胶电泳检出依赖于分子量差异。重组分子用凝胶电泳检出依赖于分子量差异。 2) 2) 结构结构: : a. a. 转化单元转化单元-宿主细胞转化宿主细胞转化 b. b. 表达单元表达单元-外源基因表达外源基因表达 3) 3) 类型类型: : 型：转录起始区调控序列型：转录起始区调控序列+ +启动子启动子+ + 终止子终止子 型型: : 转录起始区终止子转录起始区终止子 + + 翻译起始区核糖体结合序列和起始密码翻译起始区核糖体结合序列和起始密码子子+ + 终止子终止子 型型: : 转录起始区转录起始区 + + 翻译起始

46、区翻译起始区 + + 信号肽链编码区信号肽链编码区 + + 终止子终止子常称之为表达分泌型载体常称之为表达分泌型载体15.4 15.4 VectorsTAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIO ri转 录 起 始 翻 译 起 始 信 号 肽 成 熟 蛋 白 质 转 录 终 止 区C SC SC SC S-cloning site三种表达型载体结构图三种表达型载体结构图15.4 15.4 VectorsPlasmids Easy to use and store. Recombinant plasmids readily select

47、ed with antibiotics.Lambda phage Useful for cloning large (15-20Kb fragments).Cosmids Combined plasmid/phage vector permits cloning of even larger (e.g.45Kb)DNA fragments.Yeast plasmids Permit direct studies on eukaryotic gene regulation.Plant plasmids Bacterial(Agrobacterium)infection of plant transfers Ti plasmid into host plant cells.Type of Vector Advantage四、常用质粒载体举例1 1、pBR322pBR322载体载体