微生物培养、筛选与保存

1、一、复习二、微生物的生长曲线三、微生物的生长曲线的测定-方案汇报四、食品微生物检测11.微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏为什么要进行菌种保藏菌种保藏的目的菌种保藏的原理菌种保藏的方法2 斜面低温保藏法斜面低温保藏法 石蜡油封藏法石蜡油封藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 麸皮保藏法麸皮保藏法 甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 宿主保藏法宿主保藏法 2、菌种的复壮、菌种的复壮n 狭义的复壮狭义的复壮消极消极的措施的措施 指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从

2、已衰分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。恢复原菌株固有性状的相应措施。n 广义的复壮广义的复壮积极积极的措施的措施 指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮的主要方法菌种复壮的主要方法1、纯种分离法纯种分离法 菌落纯（菌落纯（“菌种纯菌种纯”）细胞纯（细胞纯（“菌株纯菌株纯”

3、） 通过纯种分离通过纯种分离, ,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来型性状的单细胞分离出来, ,经扩大培养经扩大培养, ,就可恢复原菌株的典型就可恢复原菌株的典型性状。性状。平板表面涂布法平板表面涂布法平板划线分离法平板划线分离法琼脂培养基浇注法琼脂培养基浇注法用分离小室进行单细胞分离用分离小室进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离任务一：认识生长曲线的概念任务二：为生长曲线的绘制设计实验方案7 什么是微生物的生长曲线什么是微生物的生长曲线将少量单

4、细胞的纯培养，接种到一恒定容积将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。坐标，绘制所得的曲线。910 将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡延迟期、对数期、稳定期和衰亡期期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标数或生长速率为纵坐标作图所绘制的

5、曲线称为该细菌的生长曲线生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。1112 哪些情况下需要测定微生物的生长哪些情况下需要测定微生物的生长 曲线？曲线？1.131. 任选大肠杆菌或酵母菌2.结合实验室实际情况，设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果15接下来请大家汇报实验方案本次的作业：请大家设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果A4纸打印上交四、食品微生物检测一、食品微生物的检验流程二、食品微生物样品采集与制备三、食品微生物检验1.食品中菌落总数检测2.食品中霉菌和酵母

6、菌检测四、制定实验方案19食品检验的目的食品检验的目的1.便于食品卫生质量监督管理；2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质3.为新产品、新资源利用、新食品等进行卫生鉴定一一.食品微生物检验的一般步骤食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告二、食品微生物样品采集与制备二、食品微生物样品采集与制备取样：代表性微生物检验的取样微生物检验的取样过程中，过程中，避免操作引起污染避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：即：在收

7、集过程中，本身应避免污染，然后放在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中入消毒容器中。22（一）（一） 检验前的准备检验前的准备准备好所需的各种仪器，如冰箱、水浴锅、培养箱等。准备好所需的各种仪器，如冰箱、水浴锅、培养箱等。按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。菌，冷却后送无菌室备用。准备好所用的各种试剂，制备营养琼脂或其他培养基。准备好所用的各种试剂，制备营养琼脂或其他培养基。做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前灭菌做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前灭菌3050min.准备好采样必需的工具和器材，

8、如剪刀、镊子、勺子等。准备好采样必需的工具和器材，如剪刀、镊子、勺子等。采样后样品运输、保存相关准备。采样后样品运输、保存相关准备。（二）样品的采集（二）样品的采集采样的步骤采样的步骤采样前调查采样前调查现场观察现场观察确定采样方案确定采样方案采样采样 样品封存样品封存 开具采样证明开具采样证明采样的原则采样的原则1、根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生、根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案物的危害程度等确定采样方案2、应采用、应采用随机随机原则，确保所采样品必须具有原则，确保所采样品必须具有代表性代表性。3、采样操作必须遵循、采样操作必须遵循无菌无菌

9、原则，要防止污染，防止变原则，要防止污染，防止变质、损坏、丢失。质、损坏、丢失。严格遵守样品采集的操作规程。严格遵守样品采集的操作规程。4、样品在保存和运输过程中，应采取措施、样品在保存和运输过程中，应采取措施防止防止样品中样品中原有微生物数量的变化，不得加入防腐剂、固定剂原有微生物数量的变化，不得加入防腐剂、固定剂等。等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。食品微生物检验的采样方案食品微生物检验的采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品

10、的食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性代表性至关重要，也至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案一套科学的抽样方案，其次，其次使用使用正确的抽样技术正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原保持样品的原有状态有状态。目前最为流行的抽样方案为目前最为流行的抽样方案为ICMSFICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于案。无论采取何种方法抽样，每

11、批货物的抽样数量不得少于5 5件。件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于少于8 8件。件。样品的种类样品的种类大样，就是一整批；大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般每批抽样数量不少于一般每批抽样数量不少于5件，一般为件，一般为200g；小样，也称检样，直接进行分析用的，一般小样，也称检样，直接进行分析用的，一般为为25g。食品微生物检验的采样方案食品微生物检验的采样方案ICMSF取样方案；取样方案；美国美国FDA的取样方案；的取样方案；世界粮农组织（世界粮

12、农组织（FAO）取样方案；）取样方案；我国的食品取样方案。我国的食品取样方案。ICMSF(The Intermational Committee onMicrobiological Specification for Food)国际食品微生物标准委员会 食品微生物检验采样方法食品微生物检验采样方法采样原则：采样原则： 能采取完整包装的样品就不拆开能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样操作进行取样. .1、液体样品采样方法、液体样品采样方法 充分混匀后，无菌操作打开包装，充分混匀后，无菌操作打开包装，用用100mL100mL无菌注

13、射器抽取无菌注射器抽取, ,注入无菌盛注入无菌盛样容器样容器.2、半固体样品采样方法、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。个部位挖取样品，放入无菌容器。 3、固体样品采样方法、固体样品采样方法大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品

14、品质的情况，应从深部取样。检验食品品质的情况，应从深部取样。 4、冷冻食品采样方法、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。验食品品质情况，应从深部取样。 5、生产工序监测采样、生产工序监测采样车间用水：从车间各龙头采样；车间用水：从车间各龙头采样；车间台面、用具、及加工售货员手的

15、卫生监测：车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用用5cm5cm2 2孔无菌采样板和孔无菌采样板和5 5支无菌棉签擦拭支无菌棉签擦拭25cm25cm2 2面面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。器中。车间空气采样：将车间空气采样：将5 5个直径个直径90mm90mm的普通琼脂平板分别的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min5min，然后盖盖，然后盖盖送检。送检。平皿（七）采样标签的填写（七）采样标签的填写标签内容主要：标签内容主要： 编号、样品名称、生产单位、生产日编号、样品名称、生产单

16、位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。采样时间、采样人姓名，现场情况。采样单采样单 样品编号：样品编号：产品名称（商品名）产品名称（商品名）_规格型号规格型号_注册商标注册商标_生产厂家生产厂家_通讯地址通讯地址_邮政编码邮政编码 受检地点受检地点_通讯地址通讯地址_邮政编码邮政编码 采样地点采样地点_采样日期采样日期_采样基数采样基数_生产日期生产日期_批号批号_产品依据标准产品依据标准_有效成分及含量有效成分及含量_检验目地检验目地_检测项目检测项目_ 采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承

17、认以上填采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。公正性。 代表单位（章）代表单位（章） 代表单位（章）代表单位（章） 签字签字 签字签字 日期年月日日期年月日 日期日期 年月日年月日 备注备注四四.样品的送检要求样品的送检要求 1 1、要快速运送：不要超过要快速运送：不要超过3小时；小时；2、若路途遥远，可在、若路途遥远，可在15低温下运送；低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；

18、、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。、要填写检验申请单。五五.样品的处理方法样品的处理方法（一）液体样品（一）液体样品（二）固体样品（二）固体样品（三）冷冻样品（三）冷冻样品（一）液体样品的处理（一）液体样品的处理瓶装液体样品的处理瓶装液体样品的处理盒装或软塑料包装样品的处理盒装或软塑料包装样品的处理1.瓶装液体样品的处理瓶装液体样品的处理 用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入含有二氧化碳的样品可倒入500

19、mL500mL磨口瓶内，口勿磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样逸出后，取样25mL25mL检验。检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理盒装或软塑料包装样品的处理 将其开口处用将其开口处用75%75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品剪开部分，直接吸取样品25mL 25mL ，或倾入另一灭菌容，或倾入另一灭菌容器中再取样器中再取样25mL25mL检验。检验。（二）固体样品的处理（二）固体样品的处理

20、捣碎均质法捣碎均质法剪碎振摇法剪碎振摇法研磨法研磨法整粒振摇法整粒振摇法胃蠕动均质法胃蠕动均质法1.捣碎均质法捣碎均质法将中样将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从剪碎或搅拌混匀，从中取中取25g放入带放入带225mL稀释液的无菌稀释液的无菌均质杯中，均质杯中，800010000r/min均质均质12min即可。即可。视频：无菌均质器视频：无菌均质器2.剪碎振摇法剪碎振摇法将中样将中样(100g)(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取剪碎或搅拌混匀，从中取25g25g检样进检样进一步剪碎，放入带一步剪碎，放入带225mL225mL稀释液和直径稀释液和直径5mm5mm左右玻璃左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧

21、瓶盖，用力快速振摇珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇5050次，振次，振幅要大于幅要大于40cm40cm。3.研磨法研磨法 将中样将中样(100g)(100g)剪碎剪碎或搅拌混匀，从中取或搅拌混匀，从中取25g25g检样放入无菌乳钵中充分检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有研磨后，再放入带有225mL225mL无菌稀释液的稀释无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4.整粒振摇法整粒振摇法直接称取直接称取25g25g整粒样品置于带有整粒样品置于带有225mL225mL稀释液和稀释液和直径直径5mm5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇用力快速振摇5050次，振幅要大于次，振幅要大于40cm40cm。（三）冷冻样品（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超下解冻，时间不能超过过18h，或在，或在45 下解冻，时间不能超过下解冻，时间不能超过15min。再取检样再取检样25g做稀释处理。做稀释处理。请大家参考p229 附录五附录五 中国食品微生物