电镜酶细胞化学技术应用和电镜免疫细胞化学技术应用

1、电镜酶细胞化学技术应用和电镜免疫细胞化学技术应用概述概述 电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 电镜细胞化学技术主要包括：电镜细胞化学技术主要包括： 电镜酶细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术 特异酶消化印证技术 电镜放射自显影技术 电镜原位杂交技术 超微示踪技术等第一节第一节 电镜酶细胞

2、化学技术电镜酶细胞化学技术 目的：目的： 在超微形态保存良好的组织上，在酶存在的部位在超微形态保存良好的组织上，在酶存在的部位显示酶活性。侧重于显示细胞器的标志酶及其动态显示酶活性。侧重于显示细胞器的标志酶及其动态变化。变化。 目前能在电镜下定位的酶有三大类即目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶水解酶、氧化酶和转移酶 电镜酶细胞化学与光镜酶组织化学的比较：电镜酶细胞化学与光镜酶组织化学的比较：光镜酶组织化学光镜酶组织化学 电镜酶细胞化学电镜酶细胞化学分辨率低分辨率低 分辨率高分辨率高难于鉴别细胞器和酶的精确位置难于鉴别细胞器和酶的精确位置 易于鉴别和定位易于鉴别和定位反应产物

3、为有色沉淀反应产物为有色沉淀 反应产物必需有高电子密度反应产物必需有高电子密度可显示可显示100100多种酶多种酶 可显示可显示4040余种酶余种酶电镜酶细胞化学的基本原理电镜酶细胞化学的基本原理酶细胞化学反应酶细胞化学反应 酶酶+底物底物 初级反应产物初级反应产物 最终反应产物最终反应产物 （可溶性） （不溶性）常用捕捉剂有：重金属（铅、钡、铜）盐、重氮盐、常用捕捉剂有：重金属（铅、钡、铜）盐、重氮盐、二氨基联苯胺等。二氨基联苯胺等。 。 电镜酶细胞化学反应的主要方法电镜酶细胞化学反应的主要方法 酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被氧化，底

4、物之二为捕捉底物，在反应中被还原，被还氧化，底物之二为捕捉底物，在反应中被还原，被还原的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀。原的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀。 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 琥珀酸盐琥珀酸盐 铁氰化物铁氰化物 延胡索酸盐延胡索酸盐 亚铁氰化物亚铁氰化物 CuCu2+2+ 亚铁氰化铜（高电子密度）亚铁氰化铜（高电子密度）（2 2）非金属有机化合物沉淀法）非金属有机化合物沉淀法常用底物为常用底物为-醋酸萘酚、萘酚AS-葡萄糖苷酸、 -萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物。用于显示糖苷酶、磷酸酶、酯酶糖苷酶、磷酸酶、酯酶等。初级产物：萘酚萘酚萘酚+ +捕捉剂重氮盐捕捉剂重氮盐

5、 偶氮色素偶氮色素（3 3）锇化法）锇化法嗜锇物质生成法嗜锇物质生成法 在酶作用下，生成在酶作用下，生成“嗜锇嗜锇”性捕捉底物，经锇酸作用性捕捉底物，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑后形成高电子密度的锇黑电镜酶细胞化学的常规操作流程电镜酶细胞化学的常规操作流程 酶细胞化学技术包括三个基本过程：酶细胞化学技术包括三个基本过程：酶的固定，酶的固定，使酶固定在组织细胞所在部位，防止移位；使酶固定在组织细胞所在部位，防止移位；酶的特酶的特异性反应；异性反应；使反应产物在显微镜下可见。第一过程使反应产物在显微镜下可见。第一过程在样品制备中完成，后两个过程包含在孵育反应中。在样品制备中完成，后两个过程包含

6、在孵育反应中。 取材（取材（3 38mm8mm） 固定（酶固定固定（酶固定+ +结构固定）结构固定） 切组织片（切组织片（40-60um40-60um） 孵育（酶反应孵育（酶反应+ +捕捉反应）捕捉反应） 脱水、包埋脱水、包埋 超薄切片超薄切片 电镜观察电镜观察 1 1、固定：常规固定液选取、固定：常规固定液选取2.5%2.5%戊二醛和戊二醛和4%4%多聚甲醛多聚甲醛混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单独使用其中一种作为固定液。独使用其中一种作为固定液。 选择固定剂选择固定剂 原则上优先考虑保存酶活性，一般采用醛类固定剂。原则上优先考虑保存酶

7、活性，一般采用醛类固定剂。甲醛对酶活性的保存优于戊二醛，但对细胞超微结构甲醛对酶活性的保存优于戊二醛，但对细胞超微结构的保存略差。戊二醛对细胞的超微结构的保存优于甲的保存略差。戊二醛对细胞的超微结构的保存优于甲醛，为发挥二者的长处，可采用甲醛戊二醛混合固定醛，为发挥二者的长处，可采用甲醛戊二醛混合固定液。液。固定的温度与时间固定的温度与时间 固定液的使用温度一般是固定液的使用温度一般是0-40-4。固定时间视目标酶。固定时间视目标酶对固定剂的敏感程度而定对固定剂的敏感程度而定缓冲液缓冲液 一般固定液需要用缓冲液配置，具体使用一般固定液需要用缓冲液配置，具体使用何种缓冲液要看具体酶的性质而定。常

8、用的缓冲何种缓冲液要看具体酶的性质而定。常用的缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、TrisTris缓冲液以及缓冲液以及二甲砷酸钠缓冲液等。二甲砷酸钠缓冲液等。 2 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40406060m m，也可以用冰冻切片机切片。，也可以用冰冻切片机切片。3 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3 3次，每次次，每次1010分钟。分钟。 4 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中

9、孵将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为育，孵育温度一般为3737。孵育时间因器官和酶。孵育时间因器官和酶的种类不同而有很大差异的种类不同而有很大差异( (具体时间见各种酶的具体时间见各种酶的孵育液的配方及孵育方法孵育液的配方及孵育方法) )。 孵育液的组成孵育液的组成 浓度充分的酶作用底物、捕捉剂、酶激活剂，对浓度充分的酶作用底物、捕捉剂、酶激活剂，对照试验应再加抑制剂。照试验应再加抑制剂。 孵育液配制的要求孵育液配制的要求 所用器皿应十分清洁；所用器皿应十分清洁； 用前新配制；用前新配制； 按处方顺序依次加入试剂；按处方顺序依次加入试剂； 调整调整PHPH至酶作用的最

10、适值。至酶作用的最适值。5 5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3 3次，每次次，每次1010分钟，然后用分钟，然后用0.1M0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗二甲砷酸钠缓冲液漂洗3 3次，次，每次每次1010分钟，所用缓冲液要保持在分钟，所用缓冲液要保持在44左右。左右。6 6、后固定：用、后固定：用0.1M0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的二甲砷酸钠缓冲液配置的1%1%锇酸固锇酸固定定1 1小时。小时。7 7、脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。、脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。8 8、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观、电镜观察：超薄切片

11、经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好，可以进行铅察。如果反差不好，可以进行铅铀双重染色，铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。但必须有不染色的切片对照。须注意须注意 固定切记固定切记“兼顾、协调兼顾、协调”原则，过强的固定造成酶的原则，过强的固定造成酶的活性损失，固定太弱又造成细胞结构保存不良。活性损失，固定太弱又造成细胞结构保存不良。 因锇酸能使大多数酶活性丧失，故禁忌在酶细胞化学因锇酸能使大多数酶活性丧失，故禁忌在酶细胞化学反应前使用；反应前使用； 通常用通常用0.5-2%0.5-2%戊二醛或戊二醛或4%4%多聚甲醛多聚甲醛44固定固定2 2小时小时左右（但葡萄糖左右（但葡萄糖-6-6-

12、磷酸酶、琥珀酸脱氢酶只能固定磷酸酶、琥珀酸脱氢酶只能固定几分钟）。也可用多聚甲醛几分钟）。也可用多聚甲醛-戌二醛固定。戌二醛固定。 可通过改变固定的时间、温度、固定剂的种类和浓度可通过改变固定的时间、温度、固定剂的种类和浓度调整固定的效果。调整固定的效果。 第二节第二节 电镜免疫细胞化学技术电镜免疫细胞化学技术常规电镜：形态结构常规电镜：形态结构免疫学方法：免疫学方法： 组分组分免疫电镜：形态结构免疫电镜：形态结构+ +组分组分免疫电镜延伸了免疫光镜免疫电镜延伸了免疫光镜细菌，冰冻超薄切片，免疫标记腺苷酸环化酶，醋酸铀染色 电镜免疫细胞化学：简称免疫电镜，是利用抗原电镜免疫细胞化学：简称免疫电

13、镜，是利用抗原抗体特异结合的原理，在组织细胞原位显示抗原抗体特异结合的原理，在组织细胞原位显示抗原或抗体大分子的方法。或抗体大分子的方法。标记抗体标记抗体 虽然抗原抗体结合是特异的，但却是不可见的，在电镜下也难以检测到。所以就有人提出了在抗体上结合标记物，这里要求抗体与标记物结合后，仍保持相应的生物活性，仍能与组织细胞相应抗原发生特异反应。这种抗体与标记物连接就称为抗体标记。这种抗体与标记物连接就称为抗体标记。 标记抗体的方法：标记抗体的方法：1 1、酶标记法，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酶标记法，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 葡葡萄糖氧化酶等。萄糖氧化酶等。2 2、铁蛋白标记法、铁蛋白标

14、记法 3 3、重金属标记法，如胶体金、重金属标记法，如胶体金4、同位素标记法5、荧光标记法 根据标记方法的不同， 电镜免疫细胞化学技术分为免疫酶标技术、免疫胶体金技术和免疫铁蛋白技术。过氧化物酶标记电镜免疫细胞化学技术过氧化物酶标记电镜免疫细胞化学技术 原理： 利用偶联剂将酶与抗体结合，形成酶标抗体，在抗原与酶标抗体反应后，再利用酶与底物作用生成电子密度高的沉淀物，从而可以在电镜下检出抗原反应部位。 用以标记抗体的酶要具备以下条件：用以标记抗体的酶要具备以下条件：1.1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。的生物活性。

15、2.2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。3.3.在体液或组织中不存在该酶的底物。在体液或组织中不存在该酶的底物。酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRPHRP）标记抗体法标记抗体法1.1.制备过氧化物酶标记的抗体制备过氧化物酶标记的抗体 抗体与过氧化物酶偶联的过程，方法有两种：抗体与过氧化物酶偶联的过程，方法有两种：戊二醛法：以戊二醛为偶联剂，形成戊二醛法：以戊二醛为偶联剂，形成HRP-HRP-戊二醛戊二醛- -抗体复合物。抗体复合物。过碘酸盐法：过碘酸盐法：HRPHRP中的中

16、的18%18%的糖基与酶活性无关，借助碘的糖基与酶活性无关，借助碘化作用将之氧化为醛，再通过醛基与抗体分子的氨基化作用将之氧化为醛，再通过醛基与抗体分子的氨基结合。结合。2.2.免疫染色免疫染色直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。抗原抗体反应部位。间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记

17、第二抗体，最后酶与底物然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。反应，生产沉淀。标记抗体法标记抗体法 PAPPAP法法 ABCABC法法胶体金标记电镜免疫细胞化学技术胶体金标记电镜免疫细胞化学技术一、胶体金的概述一、胶体金的概述1、胶体金的概念、胶体金的概念 从物理化学角度来说，胶体金是指直径从物理化学角度来说，胶体金是指直径1-100nm的金颗粒所形成的分散系，即金以或大或小的的金颗粒所形成的分散系，即金以或大或小的微粒分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的微粒分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小粒子分散在水中形成的金水溶胶。胶体金是指以微小粒子分

18、散在水中形成的金水溶胶。 2、胶体金的特性 颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。 影响胶体金稳定的因素： a.电解质 少量有促进稳定的作用，过量则破坏 b.胶体金的浓度 浓度越高容易导致胶体金凝集 c.温度 长时间加热可使稳定性有所下降二、胶体金标记和染色二、胶体金标记和染色 1.胶体金标记 在一定条件下，胶体金与蛋白质混合后可以牢固结合形成稳定的复合物，这个过程称为标记。其实就是蛋白质吸附在胶体金表面的过程。它们的结合主要是物理作用，所以很少引起蛋白质活性的变化。 胶体金吸附蛋白质与胶体金吸附蛋白质与PHPH值有

19、关，在接近蛋白质等电值有关，在接近蛋白质等电点或略偏碱的情况下，两者形成老固的复合物。点或略偏碱的情况下，两者形成老固的复合物。2.电镜免疫金染色 用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根据抗原的性质加以选择。 染色方法也有直接法和间接法。双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm, 20nm铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术 铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已

20、发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法仍然是一种基本技术。 基本原理：基本原理： 铁蛋白是一种直径铁蛋白是一种直径101012nm12nm的球形的蛋白质（分子的球形的蛋白质（分子量量450kD450kD）, ,它含有致密的铁胶粒核心（直径约它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm7.5nm），），该核心含该核心含2000200050005000个铁原子，分布于四个区域，形成个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形

21、成抗体- -铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。观察。 电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则一、取材与固定一、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，进行浸渍或灌注固定。新鲜，进行浸渍或灌注固定。 标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。一般采用性保存好，但是超微结构