肝病的病理形态特点及免疫组化染色体会

1、常见肝病的病理形态特点及免常见肝病的病理形态特点及免疫组化染色的几点体会疫组化染色的几点体会 复旦大学病理学系张锦生肝穿刺标本检查和处理原则肝穿刺标本检查和处理原则1. 1. 肉眼观察肉眼观察 肝穿刺标本呈完整园柱状，长度肝穿刺标本呈完整园柱状，长度1 13 cm3 cm典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块2.石蜡切片石蜡切片 每张玻片上应放置超过每张玻片上应放置超过6个连续组织切片，有助于肝纤维个连续组织切片，有助于肝纤维化的病理诊断。化的病理诊断。3. 3. 染色染色 除常规染色供病理诊断用

2、之外，根据条件除常规染色供病理诊断用之外，根据条件和需要作以下特殊染色：和需要作以下特殊染色：网状纤维染色，网状纤维染色，MassonMasson三色染色，三色染色，胶原纤维染色胶原纤维染色(Sirius red(Sirius red或免疫组化或免疫组化 ) ) Dm-HSC Dm-HSC -SMA-MFb -SMA-MFb Dm-SMAS1S2S3S4各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期1. 1. 慢性肝炎肝纤维化慢性肝炎肝纤维化 ( Dr.Scheuer( Dr.Scheuer 方案）方案）活动性纤维间隔静止性纤维间隔活动性纤维间隔静止性纤维间隔2.2.

3、脂肪性肝病肝纤维化脂肪性肝病肝纤维化 穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液小叶中央区纤维化窦周纤维化小叶中央区纤维化窦周纤维化3. 3. 肝糖原累积病肝纤维肝糖原累积病肝纤维 4. Wilson病病 红氨酸(Rubeanic acid)染色,铜被染成深绿色5. 血色病血色病 穿刺肝组织因含有大量含铁血穿刺肝组织因含有大量含铁血黄素沉着呈火焰红色黄素沉着呈火焰红色肝细胞普鲁氏蓝染色阳性6. 6. 自身免疫性肝炎肝纤维化（自身免疫性肝炎肝纤维化（AIHAIH） 门管区肝细胞呈花环状排列门管区肝细胞呈花环状排列Hepatic Rosette Hepatic Ros

4、ette ，表现为数个水样变，表现为数个水样变性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。7. 7. 原发性胆汁性肝硬化（原发性胆汁性肝硬化（PBCPBC） 3 3期（间隔期）期（间隔期）90%90%出现自身抗体出现自身抗体(A-Mit(A-Mit) )，Florid duct lesion+BiliaryFlorid duct lesion+Biliary PN PN， 纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性4 4期（肝硬化）期（肝硬化） 静止静止- - 纤维间隔内无炎症或轻度炎症纤维间隔内无炎症或轻度炎症

5、 活动活动 Fibrous PN. Fibrous PN. 8. 8. 血吸虫性肝纤维化血吸虫性肝纤维化 肝癌(LIVER CANCER) HCC ICC Combined hepatocellular and cholangiocarcinoma肝癌病理诊断常用免疫组化和特染肝癌病理诊断常用免疫组化和特染 Hep Par1 线粒体相关抗原，与AFP无关对胎儿和成人肝细胞高度特异 (HCC:阳性率82-97%） AFPHCC阳性率：15-82% CD34: HCC型染色长条分枝，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫.而非癌肝组织内极少见. CK 18: HCC,ICC, Metastatic ca

6、rcinoma:100%+ 上皮性肿瘤标志物 CK 19: 胆管型CK: CK19,CK7 肝细胞 胆管上皮，ICC：77-100% ICC最好的标志物 CEA： monoclonal CEA:毛细胆管ICC，转移性肝癌：60-75%+ HCC:0-11%+ polyclonal CEA: 毛细胆管HCC特异标志物之一 CK 20: 胃肠道腺癌的主要标志物转移性腺癌：74-100%+ ICC:10%+ HCC:0%+ MOC31: 抗人上皮相关抗原转移性腺癌：100%+ ICC: 92.9%+ HCC: 0% + 胃癌肝转移 HBsAg: HCC: 70-80% +胞质型，胞核型阳性胞质型，核

7、周型阳性 黏液染色：AB/PAS 酸性黏多糖：兰色（胆管腺瘤,ICC腔内黏液）中性黏多糖,糖原：红色（假腺管型HCC)免疫组织化学染色的几点体会免疫组织化学染色的几点体会一、组织和细胞标本制备一、组织和细胞标本制备 目的：目的： (1)最大限度地保存组织结构。最大限度地保存组织结构。 (2)最大限度地保存抗原性。最大限度地保存抗原性。 注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式目的，参考抗体说明，确定组织处理方式(冰冻冰冻?石蜡石蜡?)。1.取材 （1）原则：尽可能新鲜，动物标本可选）原则：尽可能新鲜，动物标本可选

8、用动脉灌注固定。用动脉灌注固定。 （2）取材部位：尽量包括病灶和正常组）取材部位：尽量包括病灶和正常组 织交界处，避免选择坏死组织。织交界处，避免选择坏死组织。 （3）避免挤压：受挤压组织不但影响）避免挤压：受挤压组织不但影响 HE切片的观察，还造成非特异性切片的观察，还造成非特异性 免疫组化组织着色。免疫组化组织着色。2.固定 根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。 容器要大容器要大,固定液要宽余固定液要宽余. 固定时间既要考虑充分固定固定时间既要考虑充分固定,又不能

9、太长又不能太长(依组织依组织块厚薄大小从块厚薄大小从24hr至至35天天,太长可溶性抗原会渗太长可溶性抗原会渗漏漏,阳性会减弱甚至转阴阳性会减弱甚至转阴. 选择最合适的固定剂选择最合适的固定剂,如用福尔马林如用福尔马林,必须用缓冲必须用缓冲福尔马林福尔马林3.制备蜡块 冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋温石蜡包埋,如无低温石蜡如无低温石蜡,可将组织块尽可可将组织块尽可能修薄能修薄,以缩短脱水、透明、包埋时间以缩短脱水、透明、包埋时间,尽可尽可能保存组织内抗原稳定。能保存组织内抗原稳定。4.制备冰冻切片 冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜及已固定材料均适

10、合于冷冻包埋、切片。 防止冰结晶防止冰结晶! 预处理预处理:目的是减少组织中的水分以减少冰结晶的产生,方法是将已固定、冲洗的组织块放入2030%蔗糖缓冲液内,4冰箱过夜,再将组织块埋于OCT包埋剂 速冻速冻:目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。速冻方法液氮法液氮法:将OCT包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻结后,立即移入低温冰箱(装入封口塑料袋内密封)或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片;干冰干冰-丙酮法丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达-70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干干冰冰-丙酮丙酮饱和液中;然后将OCT包

11、埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。免疫组化染色后的衬染 常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性信号在细胞核阳性信号在细胞核,切勿衬染细胞核切勿衬染细胞核! 细胞质衬染细胞质衬染:1%亮绿亮绿,但退色较快但退色较快,可改用坚可改用坚固绿固绿(FAST BLUE)染染,则保存时间较长则保存时间较长封固和保存封固和保存 绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用固，但如用DAB以外的底物应注意有以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。封固物如明胶、甘油缓冲

12、液等。 酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。 免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。一一.常用免疫组织化学方法常用免疫组织化学方法1.免疫荧光免疫荧光: 用于培养细胞效果较好用于培养细胞效果较好, 石蜡切片因常有自发荧光石蜡切片因常有自发荧光,背景荧光较强背景荧光较强,用时要注用时要注意意 FITC(异硫氰酸荧光素) 用450490 nm光激发,515nm 滤片观察, 呈翠绿色 RB200(四乙基罗达明B200) 用570nm光激发, 596 600nm滤片观察,呈橘红色 TRITC(四甲基异硫氰酸罗达明) 用530 560nm光激发,

13、580nm滤片观察,呈红色 Texas red 用595nm光激发, 615nm滤片观察,呈红色 直接免疫荧光法直接免疫荧光法: 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 双重荧光染色双重荧光染色2.免疫组织化学免疫组织化学 常用方法: PAP ABC或LSAB ELPS(二步法)20世纪70年（1970）Sternberg Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP)20世纪80年代（1981） 许世民 ABC（亲和免疫组化） Avidin-Biotin-Peroxidase Complex90年代中期：Enhanced Polymer One Step (EPOS) EnVisio

14、n (Enhanced Labelled Polymer System, ELPS)简称二步法 1 mol 含 70 mol HRP + 10 mol AB如何做好免疫组化染色?什么才是高质量的免疫组化染色什么才是高质量的免疫组化染色?阳性信号突出阳性信号突出无背景染色无背景染色切片平整切片平整无破裂无破裂/碎碎,无污秽无污秽做好免疫组化染色几点体会1.组织细胞处理: 固定剂 固定时间 速冻防冰结晶 白片质量好:平整,无破裂/碎,无污秽 防脱片 : 玻片绝对干净 涂粘合剂: 白胶 多聚赖氨酸 铬明矾明胶液 甲醛明胶液 贴片后冷风吹干或37 /60烘干 2.抗体:特异性,高效价,亲合力,适度稀释度3.石蜡切片- 抗原修复 (1)蛋白酶消化: 胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K 胃蛋白酶 消化不足- 修复失败,假阴性或信号弱 消化过度- 结构破环,脱片 (2)热修复: 微波照射 高压加热 水浴加热 (3)微波+蛋白酶消化 注意点: