肖成茂硕士答辩ppt

1、一种可生成稳定生化梯度一种可生成稳定生化梯度的新型十字微通道的新型十字微通道的制作及评价的制作及评价 答辩人：肖成茂答辩人：肖成茂 导导 师：蔡绍皙师：蔡绍皙 教授教授 专专 业：生物力学工程业：生物力学工程 学学 号：号：200819020712008190207112354n细胞趋化、迁移在众多生理、病理过程细胞趋化、迁移在众多生理、病理过程(胚胚胎形成、免疫反应、恶性肿瘤形成胎形成、免疫反应、恶性肿瘤形成)中扮演中扮演着至关重要的角色。着至关重要的角色。n在在这些生命过程中，物理、化学及生物梯这些生命过程中，物理、化学及生物梯度的大小，方向对生命进程有着非常重要度的大小，方向对生命进程有

2、着非常重要的意义。的意义。n在相关的生化梯度诱导细胞迁移研究中，在相关的生化梯度诱导细胞迁移研究中，所采用的细胞培养、迁移实验装置大体分所采用的细胞培养、迁移实验装置大体分为以下两类：为以下两类：5050多年发多年发展历程的展历程的传统微流传统微流控小室。控小室。装置分类装置分类近年来兴近年来兴起的基于起的基于光刻法的光刻法的新型微流新型微流控芯片控芯片n1）传统迁移小室）传统迁移小室 Boyden小室小室Transwell小室小室（1962） 琼脂糖平板琼脂糖平板（1952）趋化因子细胞培养基微孔滤膜趋化因子 细胞 培养基n2）现代光刻微芯片现代光刻微芯片Thomas M. Keena200

3、6Microfluidic “jets” for generating steady-state gradients of soluble molecules on open surfacesTim Scharnweber2011Rapid prototyping of microstructures in polydimethylsiloxane (PDMS) by direct UV-lithographyShing-Yi Cheng 2007A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migr

4、ation光刻是将所需要的微通道图形制成光掩模，微通道的基底材料采用透光性高的玻璃或硅制成，旋涂光刻胶，曝光，之后用湿法或干法蚀刻。在这些材料表面上形成微通道，然后再采用键合机使微通道与载玻片等实现闭合，起到封闭通道和防止漏液的作用。n以上两种方法的不足以上两种方法的不足不能不能产产生生稳稳定、定、长长期持期持续续的多生化梯度的多生化梯度细细胞多是二胞多是二维维培培养养，构构型型设计单设计单一一繁琐的制作流程和昂贵的光刻仪器繁琐的制作流程和昂贵的光刻仪器多多要键合才能闭合所加工的通道要键合才能闭合所加工的通道. . 模板制作依靠专业人员，不便于推广到普通实验模板制作依靠专业人员，不便于推广到普

5、通实验室室nMohan K. S 2006和和蒋稼欢蒋稼欢2008等人等人提出提出运用抽丝运用抽丝的手段简化的微流控芯片的制作工艺。的手段简化的微流控芯片的制作工艺。n此此法利用在液态法利用在液态PDMS或凝胶中嵌入尼龙丝或其或凝胶中嵌入尼龙丝或其它细丝，固化后将细丝抽出的方法来制作装置。它细丝，固化后将细丝抽出的方法来制作装置。n其其因制作简单、成本低廉而适用于普通实验室因制作简单、成本低廉而适用于普通实验室。n本研究基于此法，力图设计一种能兼顾传统和光本研究基于此法，力图设计一种能兼顾传统和光刻优点的新型微流控通道芯片。刻优点的新型微流控通道芯片。nMohan K. S,Verma.Emb

6、edded Template-Assisted Fabrication of Complex Microchannels in PDMS and Design of a Microfluidic Adhesive.Langmuir,2006,22,10291-10295.n贾月飞贾月飞,蒋稼欢蒋稼欢.基于微丝的基于微丝的PDMS微流动通道制作技术微流动通道制作技术.科学通报科学通报J,2008,53(17):2116-2124.1规避光刻工艺不足快速制作、成本较低、非专业者容易操作2尺寸相当、多生化参数可生成可调控、三维培养等梯度生成前期模拟浓度梯度压力梯度生物学实验在微芯片中生成VEGF浓度

7、梯度，考察血管内皮细胞在此梯度下的迁移。从而证实微芯片的实用性通道设计能在较短时间内产生稳定梯度采用常见材料制作，工艺简单可行。并且能快速制作，大量复制。研究内容包括以下方面：研究内容包括以下方面：微芯片通道设计压力梯度构建浓度梯度构建压力梯度模拟有机玻璃模具制作浓度梯度模拟抽丝法制作PDMS芯片血管内皮细胞在芯片中的迁移检测n1）通道设计通道设计n根据对流与扩散的经典公式：根据对流与扩散的经典公式：n在扩散作用下，通道中浓度的分布由上式决定在扩散作用下，通道中浓度的分布由上式决定在压力作用下，能够在中间通道介质中产生间隙渗流，在压力作用下，能够在中间通道介质中产生间隙渗流，从而对细胞施加力学

8、刺激。从而对细胞施加力学刺激。压力梯度的计算公式是压力梯度的计算公式是:nCrank J.The Mathematics of Diffusion.2nd edM.New York:Oxford University Press,1980,4241 1）通道制作通道制作PDMS Dow Corning Corporation,Sylgard 184 微方丝 TP Orthodontics,lnc2.0mm1.5mm1.0mm5.0mm10mm1.0mm7mmn1）通道制作通道制作n微通道的微通道的制作制作包含模板和微丝清洗、浇注固化、包含模板和微丝清洗、浇注固化、抽丝、亲水处理、凝胶灌注和封装

9、等抽丝、亲水处理、凝胶灌注和封装等6个主要步个主要步骤骤101通道通道实实物物图图n2）梯度的）梯度的COMSOL模拟模拟-浓度浓度nCOMSOL Multiphysics 3.5a是一款大是一款大型的高级数值仿真软件，广泛应用于型的高级数值仿真软件，广泛应用于各个领域的科学研究以及工程计算，各个领域的科学研究以及工程计算，被理工科科学家尤其是理论科学家公被理工科科学家尤其是理论科学家公认称为认称为“第一款真正的任意多物理场第一款真正的任意多物理场直接耦合分析软件直接耦合分析软件”。它能模拟科学。它能模拟科学和工程领域的各种物理过程。和工程领域的各种物理过程。n2）梯度的）梯度的COMSOL模

10、拟模拟-压力压力n3）密封性检测）密封性检测n在前期在前期PDMS涂覆工作做好的情况下，对抽微涂覆工作做好的情况下，对抽微流动腔的液体回收率进行计算。流动腔的液体回收率进行计算。n实验证实，液体回收率较高。除了滞留在琼脂实验证实，液体回收率较高。除了滞留在琼脂糖凝胶中的少许液体外，几乎全部回收。糖凝胶中的少许液体外，几乎全部回收。n即用一次性抽丝法制作的装置密封性好，无漏即用一次性抽丝法制作的装置密封性好，无漏液现象。液现象。n小结：小结：n在制作上，参照经典流体理论决定了通道的尺在制作上，参照经典流体理论决定了通道的尺寸和构型。寸和构型。n采用采用PDMS灌注、抽丝的方法生成了十字微通灌注、

11、抽丝的方法生成了十字微通道。道。n进行微通道芯片的密封性检测，结果表明在连进行微通道芯片的密封性检测，结果表明在连上外围设备后，微芯片具有良好的密封性。上外围设备后，微芯片具有良好的密封性。n在在COMSOL中进行了浓度梯度和压力梯度的模中进行了浓度梯度和压力梯度的模拟，理论上证明是可行的。拟，理论上证明是可行的。n1）浓度梯度生成与表征）浓度梯度生成与表征水FITC采用吸取而不是灌注荧光素的方式，可很好的避免通道内气泡，以及可能的漏液现象。取吸取速率260 nL/minn1）浓度梯度生成与表征）浓度梯度生成与表征n1）浓度梯度生成与表征）浓度梯度生成与表征结结果果显显示，示，SourceSo

12、urce通道的灰通道的灰度度值值最高，最高，SinkSink通道通道内内的灰的灰度度值值最低，中最低，中间间通道通道内内的灰的灰度度值值呈呈递减趋势递减趋势。在在10min10min内内通道通道内内的的浓浓度梯度梯度度达达到平衡；平衡前，到平衡；平衡前，chachambermber通道通道内内的的荧荧光强度光强度随随着着时间时间的延的延长长迅速上升；在迅速上升；在10min10min时时，三，三处处通道通道内内的的荧荧光强度均光强度均达达到各自峰到各自峰值值，随随着着时间时间的延的延长浓长浓度保持不度保持不变变。n1）浓度梯度生成与表征）浓度梯度生成与表征不同不同长长度度chambercham

13、ber中的浓度分布中的浓度分布n2）压力梯度生成与表征（使用红蓝墨水进行表征）压力梯度生成与表征（使用红蓝墨水进行表征）n2）压力梯度生成与表征）压力梯度生成与表征n2）压力梯度生成与表征）压力梯度生成与表征n2）压力梯度生成与表征）压力梯度生成与表征在长达120小时的时间里，45组只从45Pa下降到37Pa；70组只从70Pa下降到50Pa我们通过续加液体，可维持通道压力梯度7天左右的时间，足够进行相关的压力梯度下细胞趋化、迁移实验n3）细胞实验）细胞实验n为了进一步验证微流控芯片的实用性，为了进一步验证微流控芯片的实用性，选用目选用目前研究得较多的前研究得较多的VEGF生长因子，在通道中形

14、生长因子，在通道中形成成VEGF浓度梯度，浓度梯度，采用倒置相差显微镜观察采用倒置相差显微镜观察内皮细胞接种在通道中的形态、趋化及迁移等内皮细胞接种在通道中的形态、趋化及迁移等生长情况。生长情况。n3）细胞实验）细胞实验-VEGF诱导细胞迁移诱导细胞迁移n3）细胞实验）细胞实验-VEGF诱导细胞迁移诱导细胞迁移10ng/ml0ng/mln本研究在十字微通道芯片中，本研究在十字微通道芯片中，分别生成了分别生成了可可长期长期持续的浓度梯度和压力梯度。持续的浓度梯度和压力梯度。n在在微通道微通道中，细胞成功存活，生长状态良中，细胞成功存活，生长状态良好。好。n细胞细胞实验初步完成了实验初步完成了VE

15、Cs在在不同不同VEGF浓浓度梯度度梯度下的下的迁移过程迁移过程。验证了微通道的实验证了微通道的实用性。用性。 本研究本研究通过设计、制作、模拟和试验等工作通过设计、制作、模拟和试验等工作，对微芯片的加工工艺提出了新架构、，对微芯片的加工工艺提出了新架构、并并有有实践意义的实践意义的探索探索。n本本研究研究所提出的所提出的十字十字微方丝通道加工改良方微方丝通道加工改良方法，一定程度上可弥补传统方法所得通道的法，一定程度上可弥补传统方法所得通道的不足。显然不同截面乃至不同几何拓扑结构不足。显然不同截面乃至不同几何拓扑结构，可，可让让研究人员研究人员在开展相关实验时在开展相关实验时更多选择更多选择

16、。n后续工作建议后续工作建议n第一：后续工作应该继续开展构型的设计，第一：后续工作应该继续开展构型的设计，逐步探索适合于普通实验室的构型方案。逐步探索适合于普通实验室的构型方案。n从而走上既能节约科研经费，又不降低科研从而走上既能节约科研经费，又不降低科研水平的良性循环之路。水平的良性循环之路。n后续工作建议后续工作建议n十字通道的二次变换十字通道的二次变换n后续工作建议后续工作建议n第二：在生化因子的加载上，由于研究时间的限第二：在生化因子的加载上，由于研究时间的限制，没有进行压力梯度相关的细胞试验探索。制，没有进行压力梯度相关的细胞试验探索。n在后续工作中，可继续进行浓度和压力梯度综合在后

17、续工作中，可继续进行浓度和压力梯度综合加载的尝试。加载的尝试。n考虑到本实验室的生物力学学科优势，在前述两考虑到本实验室的生物力学学科优势，在前述两种参数加载的同时，把流动剪切力也加入进来，种参数加载的同时，把流动剪切力也加入进来，从而在微通道中更好的模拟出从而在微通道中更好的模拟出细胞细胞在在体内体内的生长的生长微环境。微环境。n衷心感谢我的导师蔡绍皙教授对我论文工作的指导以及这三年来对我在学业上的教诲，工作和生活中的关怀和鼓励。 n在本文的研究和撰写工作中，还得到了重庆大学的蒋稼欢老师的热情关心、指导和帮助，在此向老师表示由衷的感谢。n感谢晏小清师兄和戴小珍师姐在实验中给予我的帮助。 n感谢实验室的其他兄弟姐妹们对我的支持和帮助。n衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！n附录附录A：作者在攻读硕士学位期间撰写和发表的论：作者在攻读硕士学位期间撰写和发表的论文目录文目录n1肖成茂肖成茂, 蔡绍皙蔡绍皙, 蒋稼欢蒋稼欢, 晏小清晏小清. 一种新