酶的作用机理

1、教学内容及目的一一* * 酶的活性部位酶的活性部位 掌握确定酶活性部位的方法掌握确定酶活性部位的方法二二 酶催化反应的独特性质酶催化反应的独特性质三三* * 影响酶催化的有关因素影响酶催化的有关因素 酶催化高效的机理酶催化高效的机理四四 酶催化反应机理的实例酶催化反应机理的实例五五* * 酶活性的调节酶活性的调节 别构调节，可逆共价调节和酶原的激活别构调节，可逆共价调节和酶原的激活六六 同工酶同工酶一一 酶的活性中心及必需基团酶的活性中心及必需基团 酶是生物大分子，相对分子质量很大，酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质量较而与酶反应的底物一般是相对分子质量较小的分

2、子，有时即使是大分子底物时，反小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用。与底物接触并且发生反的一小部分作用。与底物接触并且发生反应的部位就称为应的部位就称为酶的活性中心酶的活性中心(active (active center)center)。酶的活性中心往往是若干个在。酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的此靠近的氨基酸残基氨基酸残基集中在一起形成具有集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将

3、底物转化为产物，合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。酶的必需基团酶的必需基团(essential group)(essential group) 酶的分子中存在着许多酶的分子中存在着许多功能基团功能基团，例如，例如，-NH-NH2 2、-COOH-COOH、-SH-SH、-OH-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般将与酶活性有关的基团称为酶的将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团必需基团。 必需基团可分为四种：必需基团可分为四种： 接触残基（接触残基（cont

4、act residuecontact residue） 辅助残基辅助残基(auxiliary residue)(auxiliary residue) 结构残基（结构残基（structure residuestructure residue） 非贡献残基（非贡献残基（noncontribution residuenoncontribution residue）酶活性中心证明方法酶活性中心证明方法1 1、切除法、切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明

5、切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。无关，反之，切除的肽链与活性有关。2 2、化学修饰法、化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化化学修饰学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：酶分子中可以修饰的基团有：-SH-SH、-OH-OH、咪唑基、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。多种，但专一性的修饰剂不多。 活力中心判断方法

6、：活力中心判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。与酶的活性无关。 缺点：缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存不能被修饰，说明该基团确

7、实处于活性部位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。不是活性部位的基团，而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学化学修饰可分为：修饰可分为： (1)(1)非特异性共价共接修饰：非特异性共价共接修饰： 修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价非特异性共价共价修饰。

8、修饰。 此法适用于此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位所修饰的基团只存在与活性部位，在非活，在非活性部位不存在或极少存在。判断标准是：性部位不存在或极少存在。判断标准是： 酶活力的丧失程酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；度与修饰剂的浓度成正比； 底物或竞争性抑制剂保护下可底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。防止修饰剂的抑制作用。 (2) (2) 特异性的共价修饰特异性的共价修饰 修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。如：失活。如：DIFPDIFP（二异丙基氟磷酸，结构见（二异丙基氟磷酸，结构见P118P118）可

9、专一性）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸OHOH而使酶失活。而使酶失活。DIFPDIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。 3 3、亲和标记法：、亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物含反应基团的底物类似物，作为，作为活性部位的标记试剂活性部位的标记试剂，它能，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其

10、象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团活泼的化学基团与酶与酶的活性基团的某些特定基团的活性基团的某些特定基团共价结合共价结合，使酶失去活性。如胰，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：凝乳蛋白酶最适底物为：N-N-对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-L-苯丙氨酰乙酯或苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N-N-对甲苯磺酰对甲苯磺酰- -苯丙氨酰氯甲基酮（苯丙氨酰氯甲基酮（TPCKTPCK），其分子中的氯甲基酮部分可使），其分子中的氯甲基酮部分可使酶的酶的His57His57烷基化形成酶烷基化形成酶TPCKTPCK衍生物而使酶失活。衍生物而

11、使酶失活。 4 4、XX射线衍射法：射线衍射法： 把一纯酶的把一纯酶的XX射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的X-X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。 （四）酶的活性中心的一级结构（四）酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处存在发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸频率最高的氨基酸残基是残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。如果赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性用

12、同位素标记酶的活性中心中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。级结构。 对各种蛋白水解酶进行类似的分析，对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性酶在一级结构上有惊人的相似性。见下表：。见下表： 酶酶氨基酸顺序氨基酸顺序牛胰蛋白酶牛胰蛋白酶Ser.Cys.Gly.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val牛胰凝乳蛋牛胰凝乳蛋白酶白酶Ser.Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu猪弹性

13、蛋白猪弹性蛋白酶酶Gly.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu猪凝血酶猪凝血酶.Asp.Ala.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro. 从上表可知，一些从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的5-65-6氨基酸氨基酸顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心蛋白质活性中心在种系进化上有严格的保守性。在种系进化上有严格的保守性。 酶的活性不仅与一级结构有关，而且酶的活

14、性不仅与一级结构有关，而且与其与其高级结构密切相关高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶。就某种程度而言，在酶的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。保证，高级结构破坏，酶失去活性。三、影响酶催化效率的有关因素三、影响酶催化效率的有关因素酶高效催化的机理酶高效催化的机理1 1、底物与酶的邻近效应和定向效应、底物与酶的邻近效应和定向效应2 2、底物分子的形变和扭曲、底物分子的形变和扭曲3 3、共价催化、共价催化4 4、酸碱催化、酸碱催化5 5、金属离子的

15、作用、金属离子的作用6 6、活性部位的微环境的影响、活性部位的微环境的影响酶酶与与底底物物相相互互诱诱导，导，发发生生形形变变断断裂裂常见酶的催化机理常见酶的催化机理 通过基因突变，从同一个祖先取得不同的专一性，称为趋异进化，有些酶来源各异，但是催化三联体组成相同，有相似的催化机制，这种情况称为丝氨酸蛋白族异源的趋同进化。 五 别构调控 别构酶别构酶，又称，又称变构酶变构酶，指酶分子的非催化部位，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称

16、为用称为别构调节别构调节(allosteric regulation)(allosteric regulation)，具有变，具有变构调节的酶称别构酶构调节的酶称别构酶(allosteric enzyme)(allosteric enzyme)。凡能使。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为别构剂酶分子发生别构作用的物质称为别构剂(effector)(effector)。 别构酶多为别构酶多为寡聚酶寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在变构剂），这

17、两部位可以在不同的亚基上，或者在同一亚基的两个不同部位。同一亚基的两个不同部位。 （二）别构酶作用特点（二）别构酶作用特点 1 1、一般别构酶分子上有二个以上的底物结合位点。一般别构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物当底物与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现正协同效应正协同效应( (positivecooperative effect)positivecooperative effect)，或出现，或出现负协同负协同效

18、应效应（negative cooperative effectnegative cooperative effect）。）。2 2、正协同效应的别构酶正协同效应的别构酶其其速度速度- -底物浓度曲线底物浓度曲线呈呈S S形形，即底，即底物浓度较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度物浓度较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强，最终达到最大值后，酶活性显著加强，最终达到最大值VmaxVmax。如大肠杆菌的。如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶天冬氨酸转甲酰基酶（ATCaseATCase）对底物天冬氨酸的结合表现）对底物天冬氨酸的结合表现为为正协同效应。正协同效应。3 3

19、、负协同效应的别构酶负协同效应的别构酶其其速度速度- -底物浓度曲线底物浓度曲线为为类似双曲类似双曲线线。底物浓度较低时，底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但酶表现出较大活性，但底物浓度明底物浓度明显增加时，显增加时，其反应速度无明显变化。如其反应速度无明显变化。如3-3-磷酸甘油醛脱氢磷酸甘油醛脱氢酶对酶对NADNAD+ +的结合为负协同效应，其的结合为负协同效应，其意义在于意义在于无论细胞内酶无论细胞内酶的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要。以满足细胞的基本需要。 4 4、别构酶除活性中心外，还存在着能与变

20、构剂作用的亚、别构酶除活性中心外，还存在着能与变构剂作用的亚基或部位，称基或部位，称调节亚基调节亚基( (或部位或部位) )。别构别构剂与调节亚基以剂与调节亚基以非非共价键共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构剂称剂称别构别构激活剂激活剂，它能使上述，它能使上述S S型曲线左移，饱和量的变型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将构激活剂可将S S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的变构剂称弱的变构剂称别构别

21、构抑制剂抑制剂，能使，能使S S形曲线右移。例如，形曲线右移。例如，ATPATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADPADP、AMPAMP为其变构激活为其变构激活剂。剂。 5 5、由于、由于别构酶动力学别构酶动力学不符合不符合米米- -曼氏酶曼氏酶的动力学，所以当反的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用K Km m表示，表示，而代之以而代之以K K0.5S0.5S表示。表示。 协同指数与饱和比值（三）生理意义（三）生理意义 1 1、在正协同效应的别构酶的、在正协同效应的别构酶的S S形曲线中段形曲线

22、中段，底物浓度稍，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底细胞内底物浓度的变化物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。来灵敏地控制代谢速度。 2 2、别构抑制剂别构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过代谢通路的入口，通过反馈抑制反馈抑制，可以及早地调节整个，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的

23、底物消耗。代谢通路，减少不必要的底物消耗。 例如例如葡萄糖的氧化分解葡萄糖的氧化分解可提供能量使可提供能量使AMPAMP、ADPADP转变成转变成ATPATP，当当ATPATP过多过多时，时，通过变构抑制剂通过变构抑制剂ATPATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而而ADPADP、AMPAMP增多时增多时，则可通过变构激活剂，则可通过变构激活剂AMPAMP、ADPADP激活磷酸果糖激酶的激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解。随时调节活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADPATP/ADP的水平，可的水平，可维持细胞内能量维持细胞内能量的正常的

24、正常供应。供应。 二、共价调节酶二、共价调节酶 1 1、概念：、概念： 也称共价修饰酶，指一类可在其它酶的作用下其结构也称共价修饰酶，指一类可在其它酶的作用下其结构通过共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为通过共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共共价修饰调节价修饰调节(covalent modification regulation)(covalent modification regulation)，这，这类酶称为类酶称为共价修饰酶共价修饰酶(prosessing enzyme)(prosessing enzyme)。 一些酶的巯基发生一些酶的巯基发生可逆的氧化还原修饰可逆的氧化

25、还原修饰，一些酶以共，一些酶以共价键与磷酸、腺苷等基团的价键与磷酸、腺苷等基团的可逆结合可逆结合，都会引起酶结构，都会引起酶结构的变化而呈现不同的活性。的变化而呈现不同的活性。酶的共价修饰是体内代谢调酶的共价修饰是体内代谢调节的另一重要的方式。节的另一重要的方式。2 2、特点：、特点： 共价修饰酶通常有共价修饰酶通常有活性活性与与非活性非活性两种形式，两种形式之两种形式，两种形式之间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中的的糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种，从脱

26、磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶化酶b b激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化。激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化。 目前已发现有几百种酶被翻译后都需要进行目前已发现有几百种酶被翻译后都需要进行共价修饰共价修饰，其中一部分处于其中一部分处于分支途径分支途径，对其代谢流量起调节作用的关，对其代谢流量起调节作用的关键酶，属于这种键酶，属于这种酶促共价修饰系统酶促共价修饰系统。由于这种调节的生理。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。放大反应，所以日益引人注目。 酶原的激活酶原的激活 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。 除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白除消化道的蛋