自生固氮菌的分离鉴定

1、自生固氮菌的分离鉴定杨从发1，王淑军1，陈静1，许兴友2(1.淮海工学院食品工程系，江苏连云港，222005)(2.淮海工学院化学工程系，江苏连云港，222005)淮海工学院学报，1999，8（2）摘要：从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到213个在无氮培养基上能良好生长的菌株，通过酶活测定，从中筛选得到18株固氮能力较强的菌株，并对其中酶活最高的4株菌株进行了鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。关键词：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料0引言微生物肥料的一些作用和生态效益是化学肥料所不具备的1，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生长和抑制

2、有害微生物的活动，从而达到增产的目的2。此外，生产微生物肥料投资少，可利用农副产品就地取材。因而，微生物肥料的生产吸引了许多研究者的兴趣。本文报道从水稻、小麦、玉米和蔬菜等非豆科作物根际土壤中分离得到18株固氮能力较高的自生固氮菌，并对其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株进行了分类鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。1材料和方法1.1菌种采集水稻、小麦、玉米和蔬菜等农作物的根际土壤土样56个，从中分离获得213株在无氮培养基上能良好生长的菌株。1.2分离培养基及分离方法1.2.1富集培养基蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1

3、g，质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL，水1000mL，pH为6.57.0，在250mL三角瓶中，每瓶分装30mL，灭菌备用。1.2.2富集培养方法取35g土样用50mL水制成混浊液，吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶中，100rpm，28，培养35天后，换新鲜培养基继续培养，重复45次后，稀释分离。1.2.3平板分离培养基在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。1.2.4分离方法取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基。28培养2天后，将在稀释度较大的平板上，生长较大的菌落移入斜面。培养后，

4、保藏备用。1.3固氮酶活性测定1.3.1气相色谱法参考文献3的方法，略加改变，将2mL乙炔气体冲入试管斜面内，塞上无菌橡皮塞，28，培养24h后，用气相色谱仪测量固氮酶的活性，每种取45个重复，进样量100L，按以下公式进行计算酶活。EA1=(58.0SeTPe)/(SbTePt)(mol/h(斜面)Se：乙烯峰面积;T：开氏绝对温度(T=273.13K)Pe：实验条件下的大气压强(Pa);Sb：乙炔峰面积;Te：实验条件下的温度(K);P：绝对大气压强(P=101324.72Pa);t=培养时间(t=24h)1.3.2微量凯氏定氮法4 用以下公式计算含氮量： EA2=(V1-V2)14100

5、0)/V(mg/L)V1：样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;V2：空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;14：是1个毫克当量氮的毫克数;V：发酵液样品毫升数。2结果和讨论2.1分离结果从非豆科作物根际土壤中分离得到213个菌株，用气相色谱法和微量凯氏定氮法测定它们的固氮酶活性。结果发现，34株没有固氮能力(含氮量10mg/mL)，其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌产酶能力最高。表1对固氮能力较强的18株菌株的酶活测定结果进行了统计。表1：固氮酶活力测定结果(18株菌株)表1中，EA1(mol/h斜面)是用气相色谱法测定各菌株的试管斜面的固氮酶活性值。按以下公式

6、计算： EA1=(58.0SeTPe)/(SbTePt)虽然理论上，在固定条件下，乙炔还原活性与固氮酶对氮气的固定活性呈正相关，但在实际实验过程中，会由于斜面的新鲜程度，斜面培养基中的某些组成等原因，而影响实验结果的准确性，所以，每种菌都取5支对数生长期的斜面做重复试验，以尽量减少误差。EA2(mg/L)是将菌株接种到无氮培养液中，28，100rpm培养7天后，用微量凯氏定氮法测定最终发酵液的含氮量。按以下公式计算：EA2=(V1-V2)141000)/V(mg/L)经回归分析6，EA1与EA2呈强正直线相关(相关系数r=0.9527)，回归方程为EA2=7.9560+0.5016EA1，其结

7、果与文献3的有关报道相似。2.2鉴定结果2.2.1形态特征 见表2所示。表2 形态特征2.2.2生理生化特征 见表3所示。表3 生理生化特征表4 褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷单孢菌模式种的特征52.2.3命名根据以上形态和生理生化特征，参照伯杰细菌鉴定手册(表4、表5列出了其中有关模式种的鉴别特征)，将以上四株菌命名如下：am65：与固氮菌科，氮单胞菌属的敏捷单胞菌相近，但甘露醇发酵及淀粉分解试验与模式种不同，暂定名为氮单胞菌am65(Azom onas sp.am65)。bn72：与固氮菌科，固氮菌属的褐球固氮菌相同，定名为褐球固氮菌bn72(Azotobacter chroococ- cu

8、m bn72)。cx58：为固氮菌科，拜叶林氏菌属。兼有弗来明拜叶林氏菌和运动拜叶林氏菌的部分特征，其种的特征还有待于进一步鉴定，暂定名为拜叶林氏菌cx58(Beijerinck ia sp.cx58)。dy82：与固氮菌科，固氮菌属，拜氏固氮菌相同，定名为拜氏固氮菌dy82(Azotobacter beijerinckii dy82)。表5拜叶林氏菌属内运动拜叶林氏菌和弗来明拜叶林氏菌的特征5注：+：少数细胞，绝大多数在幼龄时期; *：数字是代表在培养基上生长的菌株的百分数;+(-)：大约所测定菌株的40%50%为阳性; +：生长好; -/W：反应阴性或弱。参考文献：1陈廷伟,葛诚.我国微生物肥料发展趋向J.土壤肥料,1995,(6):1620.2李元芳.有效活菌数的测定方法允许差与判定J.土壤肥料,1997,(4):4344.3程萍.固氮菌肥料生产菌株的酶活性测定J.土壤