实验七酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法

1、实验六实验六 酵母菌的形态观察及微生物的显酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法微直接计数法一、实验目的一、实验目的1 1 学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。 2 2 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下微生了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下微生物直接计数的方法。物直接计数的方法。二、实验原理二、实验原理1 1 酵母菌酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别形态观察及死活细胞的鉴别 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出

2、芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片或水殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片或水碘液碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具

3、有强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。2 2 血球计数板的计数原理血球计数板的计数原理三、实验材料与器材三、实验材料与器材n菌种：酿酒酵母菌种：酿酒酵母n 培养基和试剂：麦芽汁琼脂培养基，培养基和试剂：麦芽汁琼脂培养基，0.05 和和0.1 吕氏吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液.n显微镜，玻片血球计数板、盖玻片（显微镜，

4、玻片血球计数板、盖玻片（22mm22mm）、）、 吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四四 操作步骤操作步骤（一）酵母菌形态观察（一）酵母菌形态观察1、菌种活化、菌种活化将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，2528培养培养48 h左右备用。左右备用。2、美蓝镜片的观察、美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，

5、然后慢慢将盖玻片放）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。下使其盖在菌液上。3）将制片放置约）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。4）染色约）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。 5）用）用0.5%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。3、水一碘液镜片的观察、水一碘液镜片的观察 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加

6、在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。 注意事项注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。大量气泡而影响观察。2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。（二）微生物显微镜直接计数（二）微生物显微镜直接计数 1 1视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般

7、稀释到1010-2-2，每个小方格，每个小方格5 51010个菌体为宜），以每小格的菌数可数个菌体为宜），以每小格的菌数可数为度。为度。2 2取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3 3将酵母菌悬液摇匀，用滴管或毛细吸管吸取少许，由盖玻将酵母菌悬液摇匀，用滴管或毛细吸管吸取少许，由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，使计数室充满菌液。数室，使计数室充满菌液。4 4 静置静置5 5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下分钟，将血球计数板置载物台上夹稳

8、，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。5计数时若计数区是由计数时若计数区是由16个个中方格组成，按对角线方位，中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即个大方格（即100小格）的小格）的菌数。如果是菌数。如果是25个中方格组成个中方格组成的计数区，除数上述四个大方的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央格外，还需数中央1个大方格个大方格的菌数（即的菌数（即80个小格）。如菌个小格）。如菌体位于格线上，计数时则数上体位于格线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。以减少误差。(调节光亮度和聚调节光亮度和聚光器使计数区的格线清晰光器使计数区的格线清晰)6对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数作为两个菌体计算。每个样品重复计数23次（每次数值次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（胞平均数（N），按公式计算出每），按公式计算出每ml菌悬液所含酵母菌细菌悬液所含酵母菌细胞数量。