蛋白诱导表达分子生物学实验课件

1、蛋白诱导表达分子生物学实验20112011年分子生物学实验年分子生物学实验考考 试试 安安 排排n科科 学学 素素 质：质：10%10%n实实 验验 操操 作：作：20%20%n实验结果与报告：实验结果与报告：40%40%n实验原理与理论：实验原理与理论：30%30%蛋白诱导表达分子生物学实验 课堂提问课堂提问 原始实验记录原始实验记录 团队合作团队合作 课堂纪律课堂纪律 仪器、用具的使用仪器、用具的使用 台面整洁台面整洁 考勤考勤 卫生值日卫生值日蛋白诱导表达分子生物学实验1 1、根据老师的平时观察，、根据老师的平时观察，2 2、通过一学期的强调与要、通过一学期的强调与要求，以最后两次实验的

2、求，以最后两次实验的操作为主要评分依据。操作为主要评分依据。蛋白诱导表达分子生物学实验实验结果与报告实验结果与报告根据个人所有实验的结果与实验根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。报告的评分，取平均分。蛋白诱导表达分子生物学实验实验原理与理论实验原理与理论 考试时间：第考试时间：第1313周（周（5 5月月1616日日-20-20日）日） 考试地点：本教室考试地点：本教室 考试形式：每个同学按学号单独考试，抽签题目考试形式：每个同学按学号单独考试，抽签题目（1+21+2），口述回答问题，由老师和助教评分。），口述回答问题，由老师和助教评分。 考试内容：考试内容： 1 1、实验原理步

3、骤：分子克隆总流程、实验原理步骤：分子克隆总流程+10+10次实验原理步骤次实验原理步骤（共（共1111个题，抽其中个题，抽其中1 1题详细回答）题详细回答） 2 2、实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注、实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。（抽其中意事项，理论知识，操作要点等。（抽其中2 2题简要回题简要回答）答）蛋白诱导表达分子生物学实验实实 验验 九九蛋白质的诱导表达蛋白质的诱导表达蛋白诱导表达分子生物学实验背景理论知识背景理论知识Section 1蛋白诱导表达分子生物学实验掌握蛋白质诱导表达的原理掌握蛋白质诱导表达的原理学习蛋白质诱导表达的

4、方法学习蛋白质诱导表达的方法了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点蛋白诱导表达分子生物学实验外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞基因工程的最终目的蛋白诱导表达分子生物学实验主要步骤主要步骤制备表达载体制备表达载体制备目的制备目的DNA将目的将目的DNA 克隆到载体上克隆到载体上 操作操作1. 酶切酶切, 去磷酸化去磷酸化2. 胶回收纯化胶回收纯化1. 质粒纯化质粒纯化/PCR2. 酶切酶切3. 胶回收纯化胶回收纯化1. 目的片断与载体连接目的片断与载体连接2. 转化非表达型宿主菌转化非表达型宿主菌3

5、. 筛选阳性克隆筛选阳性克隆: 菌落菌落PCR, 质粒质粒提取酶提取酶,测序确定阅读框测序确定阅读框蛋白表达操作流程蛋白表达操作流程蛋白诱导表达分子生物学实验 转化表达宿主菌转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白纯化目的蛋白1. 转化带有转化带有T7RNA 聚合酶基因聚合酶基因 的菌株的菌株1. 检测质粒稳定性检测质粒稳定性2. 确定表达时间和温度的最佳条件确定表达时间和温度的最佳条件3. 分析蛋白溶解性和活性分析蛋白溶解性和活性4. SDS-PAGE, Western 印迹等印迹等 确定目的蛋白确定目的蛋白1. 放大培养放大培养2. 制备粗提物制备粗提物3.

6、亲和纯化亲和纯化4. 切除融合标签并去除蛋白酶切除融合标签并去除蛋白酶蛋白诱导表达分子生物学实验蛋白质表达系统原核表达系统原核表达系统简单简单, ,便宜便宜, ,大量大量, ,无修饰无修饰蛋白诱导表达分子生物学实验大大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。低，生产成本低廉。9.1.2 9.1.2 原核表达的特点原核表达的特点 细菌细菌RNARNA聚合酶不能识别真核基因启

7、动子聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因真核基因mRNAmRNA无无SDSD序列，不能启动翻译序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体不溶性的包涵体蛋白诱导表达分子生物学实验在在E.ColiE.Coli中表达重组蛋白功能最强大中表达重组蛋白功能最强大 目的基因受噬菌体目的基因受噬菌体T7T7强转录及翻译信号控制强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的表达由宿主细胞提供的T7 RNAT7

8、RNA聚合酶诱导聚合酶诱导 充分诱导充分诱导: : 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, , 数小时后达细胞总蛋白的数小时后达细胞总蛋白的50%50%以上以上 非诱导条件下非诱导条件下: : 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录可使目的基因完全处于沉默状态而不转录蛋白诱导表达分子生物学实验 结构基因：编码结构基因：编码 - -半乳半乳糖苷酶（糖苷酶（Z Z）、透性酶）、透性酶（Y Y）和硫半乳糖苷乙酰）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（转移酶（A A）的基因。）的基因。 操纵子：包括启动子、操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白

9、调节基因、阻遏蛋白 乳糖乳糖+ +阻遏蛋白，改变阻阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。遏蛋白的形状。9.1.3 9.1.3 乳糖操纵子乳糖操纵子蛋白诱导表达分子生物学实验9.1.4 9.1.4 诱导原核表达的原理诱导原核表达的原理E.E.ColiColi BL21BL21（DE3DE3）：）：DE3DE3是整合在细菌基因组上的一是整合在细菌基因组上的一种携带种携带T7 RNAT7 RNA聚合酶基因和聚合酶基因和lacIlacI基因的基因的噬菌体，其噬菌体，其基因型为：基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1

10、 sam7 nin5lacIlacI产生的阻遏蛋白与产生的阻遏蛋白与laclac操纵基因结合，从而不能操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTGIPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。基因大量转录并高效表达。蛋白诱导表达分子生物学实验蛋白诱导表达分子生物学实验9.1.5 9.1.5 蛋白原核表达载体蛋白原核表达载体 具备与克隆载体相同的条件：自主复制

11、具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，序列，可供筛选的遗传性状，MCSMCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、还必须具有用于外源基因表达的启动子、SDSD序列、及转录终止子等元件。序列、及转录终止子等元件。 pETpET系列：系列：6 His Tag 6 His Tag （660Da-2kDa660Da-2kDa） pGEXpGEX系列：系列：GST GST （26kDa26kDa） pMALpMAL系列：系列：Maltose Binding Protein Maltose Binding Protein （52kDa52kDa）蛋白诱导表达分子生物学实验pETpET

12、系列系列蛋白诱导表达分子生物学实验pGEXpGEX系列系列蛋白诱导表达分子生物学实验pMALpMAL系列系列蛋白诱导表达分子生物学实验9.1.6 9.1.6 融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白: : 将两个或多个开放阅读框按一定顺序连将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接接, , 融合阅读框表达出一杂合蛋白融合阅读框表达出一杂合蛋白融合标签融合标签: : 1. 1. 保护目的蛋白使之不被降解保护目的蛋白使之不被降解 2. 2. 用于检测和纯化目的蛋白用于检测和纯化目的蛋白 3. 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中帮助将目的

13、蛋白运转到细胞周质中 以提高其生物活性以提高其生物活性蛋白诱导表达分子生物学实验9.1.7 9.1.7 阅读框架的保证阅读框架的保证蛋白诱导表达分子生物学实验pGEXpGEX系列系列蛋白诱导表达分子生物学实验D DNANA转录和转录和RNARNA翻译，即遗传信息从基因流向翻译，即遗传信息从基因流向RNARNA又流向蛋白质又流向蛋白质的过程总称为基因表达的过程总称为基因表达, ,基因表达可以在不同的水平上进行调基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。和翻译等都属于基因

14、表达的调控。l影响转录水平的因素：强启动子，强终止子影响转录水平的因素：强启动子，强终止子 等。等。l影响翻译水平的因素：影响翻译水平的因素：SDSD序列，序列，mRNAmRNA稳定性等。稳定性等。1.1.影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。9.1.8 9.1.8 影响表达效率的主要因素影响表达效率的主要因素蛋白诱导表达分子生物学实验9.1.9 9.1.9 优化表达优化表达 （1 1） 增加蛋白质溶解性及折叠增加蛋白质溶解性及折叠: : 温度温度: 37 : 37 C C 蛋白质以聚集的形式表达蛋白质以聚集的形式表达-包涵体包涵体 30 30 C C

15、 可溶的有活性的蛋白可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位细胞周质定位: : 有利于蛋白折叠及二硫键的形成有利于蛋白折叠及二硫键的形成 稀有密码子稀有密码子: : 多数氨基酸都有一个以上的密码子多数氨基酸都有一个以上的密码子, , 但有一些但有一些 E.ColiE.Coli很少很少 使用使用, , 当异源目的基因的当异源目的基因的mRNAmRNA过表达时过表达时, tRNA , tRNA 的数量直接的数量直接 反应密码子的偏倚性反应密码子的偏倚性, , 一个或多个一个或多个tRNAtRNA的稀有或缺少会导的稀有或缺少会导 致翻译的停止致翻译的停止 毒性基因和质粒稳定性毒性基因和质粒稳定性: : 抗生

16、素的使用抗生素的使用 补充葡萄糖补充葡萄糖蛋白诱导表达分子生物学实验 提高翻译水平：提高翻译水平： 调整调整SDSD序列与序列与AUGAUG间的距离、点突变改变碱基、增加间的距离、点突变改变碱基、增加mRNAmRNA稳定性稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平：减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象）负荷、恢复天然

17、构象）9.1.9 9.1.9 优化表达优化表达 （2 2）蛋白诱导表达分子生物学实验实验操作实验操作Section 2蛋白诱导表达分子生物学实验9.2.1 9.2.1 实验器材实验器材1 1、基因工程菌、基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-eGFPBL21(DE3)/pET28a-eGFP 每位同学（每位同学（20ml20ml菌液菌液/ /三角瓶）三角瓶）2 2、IPTG IPTG （乳糖结构类似物）（乳糖结构类似物）3 3、LB(KanLB(Kanr r) )4 4、离心机、离心机蛋白诱导表达分子生物学实验9.2.2 9.2.2 实验步骤实验步骤(1)(1)原核表达载体转化到原核表达

18、载体转化到BL21(DE3)BL21(DE3)菌株中。菌株中。挑取单菌落于挑取单菌落于2mL Kan2mL Kan+ + LBLB培养基培养过培养基培养过夜。夜。（已做）（已做）以以5%5%的比例转接于的比例转接于20mL Kan20mL Kanr r LB LB培养基培养基中，培养约中，培养约1 1小时至小时至ODOD600600=0.6=0.6，即可开始，即可开始诱导目的蛋白的表达。诱导目的蛋白的表达。取取1mL1mL菌液菌液, ,制样作为未诱导对照。制样作为未诱导对照。三角瓶中加入三角瓶中加入IPTG 40uL(0.5M)IPTG 40uL(0.5M)至终浓度至终浓度为为1mM1mM，继续培养。，继续培养。蛋白诱导表达分子生物学实验取样：分别于培养后，取样：分别于培养后，30, 6030, 60，